铁死亡(Ferroptosis)，一种受调节的细胞死亡方式，其特征是不受约束铁依赖性（磷酸）脂质过氧化。值得注意的是，铁死亡在治疗对化疗耐药和高侵袭的癌症极具潜力。因此，寻找潜在的治疗靶点来诱导铁死亡已经成为治疗这些耐药癌症的重要策略。在细胞中存在多种防御系统来排毒（detoxify）有害的磷脂氢过氧化物（PLOOH），以避免铁死亡。其中，硒 (selenium)依赖性谷胱甘肽过氧化物酶4（GPX4）通过消耗谷胱甘肽（GSH）直接将PLOOH还原为相应的醇来抑制铁死亡。作为硒蛋白家族成员之一，GPX4在其活性位点携带硒代半胱氨酸（selenocysteine,Sec），这对于其实现完整的GPX4酶活性，防止过氧化物引起的不可逆过氧化以及酶失活至关重要。除了GSH/GPX4系统之外，一系列基因筛查表明还存在其它的铁死亡监测系统, 比如NAD(P)H/ferroptosis suppressor protein-1 (FSP1)/ubiquinone or vitamin K system, di-/tetrahydrobiopterin/GTP cyclohydrolase 1 (GCH1)/dihydrofolate reductase (DHFR) system, and 7-dehydrocholesterol reductase(DHCR7)。与 GPX4 不同，这些系统可以还原磷脂过氧自由基 （phospholipid peroxyl radicals）来阻止脂质过氧化链反应。类似于 GPX4，不依赖于硒的过氧化还原6(PRDX6)，属于六个硫醇特异性抗氧化蛋白家族成员之一，据报道直接将 PLOOH 还原成相应的醇。有趣地是，PRDX6 是一种双功能酶 （bifunctional enzyme）具有谷胱甘肽过氧化物酶和磷脂A2 (PLA2) 活性，其过氧化物酶活性取决于47位有催化活性的半胱氨酸残基并使用辅因子GSH 作为生理还原剂。早期研究表明PRDX6 的基因扰动使癌细胞更容易容易发生铁死亡。此外，PRDX6 已被在遗传筛选和基因簇分析中反复确认是识别参与铁死亡调节的基因。然而，PRDX6对铁死亡易感性或其对 PLOOH的还原调节机制，仍然知之甚少。
在这项研究中，作者着手阐明PRDX6 通过防止失控脂质过氧化来调节铁死亡的所谓机制。与预期相反，PRDX6决定铁死亡敏感性既不取决于其细胞内 PLOOH 还原也不取决于其PLA2 活性，而是作为硒受体蛋白参与包括GPX4在内的硒蛋白生物合成过程。这些发现表明PRDX6是细胞内硒利用关键参与者，从而加深了对PRDX6如何影响铁死亡敏感性的理解。
PCOOH reduction capacity is preserved in GPX4-deficient cells
为了评估GPX4 在 PLOOH 还原中的确切贡献，作者建立了一种基于质谱的方法来评估使用细胞裂解物样品的PLOOH 还原程度（图1A). 为此,氘标记的磷脂酰胆碱氢过氧化物（PCOOH-d9)与酶或细胞裂解液一起孵育1小时，之后使用色谱-串联质谱(LC-MS/MS)评估 PCOOH 还原程度。基于亲和力纯化的GPX4（Affinity-purified GPX4）可以剂量依赖地还原PCOOH-d9，验证了方法的可行性（图1B).。当PCOOH-d9与HT-1080的细胞裂解液孵育后，大约70%的PCOOH被还原（图1C). GPX4 KO HT-1080细胞裂解液的还原能力比野生型WT降低10%左右,但是可以通过过表达GPX4来恢复。然而，有趣的是，PCOOH还原活性仍然保留在GPX4 KO 细胞中（PCOOH 减少65%）。这些发现表明GPX4 可能不是负责整体细胞PCOOH 还原的主要酶，并暗示可能存在非GPX4依赖的PCOOH 还原途径。因此，作者把注意力转移到了PRDX6上，一种假定的GPX4替代酶，据报道具有还原PLOOH的活性。
Overexpression of PRDX6 fails to protect against ferroptosis
接下来，作者使用建立的LS-MS/MS方法探索了PRDX6对PCOOH 还原能力。重组PRDX6表现出PCOOH还原活性；然而，其活性远低于GPX4（图1D）。尽管GPX4 在45 nM可以完全将PCOOH 还原，但即使浓度为 300 uM，PRDX6也仅能还原约 60% 的PCOOH。此外，从 PRDX6 KO HT-1080 细胞收集细胞裂解液也表现出PCOOH 还原能力（图 1E）。此外，从PRDX6 KO 细胞收集细胞裂解液和重组hPRDX6显示出相当的PCOOH还原能力。此外，小鼠PRDX6 的过度表达并不能保护细胞免受铁死亡（图1F）。因此，作者得出结论，过度表达PRDX6与 GPX4 不同，不会显著增加细胞还原PCOOH 的能力，也不抑制铁死亡。
PRDX6 deletion decreases GPX4 expression and sensitizes cancer cells to ferroptosis
进一步研究PRDX6 在铁死亡中的潜在调节作用，作者检查了它对GPX4 表达的影响。值得注意的是，敲除PRDX6显着降低了 HT-1080细胞中GPX4蛋白表达（图2A），这与任何其它 PRDX 家族成员的敲除形成对比(PRDX1-5)(图2B)。 GPX4表达降低也在多种PRDX6 KO 癌细胞系中观察到（图2C）。PRDX6和 GPX4 蛋白表达显著的相关性分析(www.depmap.org)也支持这一发现（图2D）。和 WT 细胞相比,经过多种铁死亡诱导剂和增敏剂处理的PRDX6敲除的HT-1080细胞对铁死亡的敏感性增加（图 2E）。PRDX6 KO HT-1080 细胞对铁死亡增加的敏感性完全被铁死亡抑制剂liproxstatin-1 (Lip-1) 抑制。此外，PRDX6 KO 持续增加对铁死亡的敏感性在RSL3和erastin处理的各种癌细胞系中也被观察到（图2F）。这些结果表明PRDX6对GPX4表达有着重要作用，进而调控铁死亡。
PRDX6 is involved in intracellular selenium metabolism
基因本体分析显示硒蛋白合成因子富集。此外，作者发现无偏倚共必需数据库工具也表明PRDX6与参与硒蛋白合成的基因之间存在很强的功能联系（图3A 3B）。作者发现PRDX6 KO细胞和WT细胞之间GPX4 mRNA的水平没有明显差异（图3C）。之后，作者研究了在PRDX6 KO中硒补充 （selenium supplementation）对GPX4的影响。添加L-Selenocystine (L-硒代胱氨酸) (the dimeric and oxidized form of L-selenocysteine; Sec2) or sodium selenite (Na2SeO3)到细胞培养基中，可以剂量依赖的增加GPX4的表达(图 3D)。此外，硒补充可以降低PRDX6 KO 细胞的铁死亡敏感性(图3E)。为了进一步探索selenium, PRDX6 和GPX4的关系，作者研究了硒缺乏（selenium deficiency）的影响。当细胞在硒缺乏的培养基培养48 h后，WT细胞的GPX4表达下降，而在PRDX 6 KO细胞中几乎检测不到GPX4的表达。硒补充后可以几乎完全恢复GPX4的表达(图3F)。尽管WT HT-1080细胞在硒缺乏的条件下可以存活，但是PRDX6 KO细胞活力显著下降, LIP-1和硒补充可以恢复细胞活力。这就表明硒剥夺（selenium deprivation）诱导PRDX6 KO 细胞铁死亡 (图3G 3H)。硒剥夺后也观察到了脂质过氧化 (图3I). 这些结果表明PRDX6参与硒的代谢以及硒蛋白的调控表达，包括GPX4。支持这一观点，其他硒蛋白（如SELENOT）的表达水平，与WT细胞相比，在PRDX6 KO细胞中，SELENOS和SEPHS2的含量也较低（图3J）。
Cysteine 47 of PRDX6 is involved in selenium handling
为了探究PRDX6硒代谢的分子基础，作者关注的是与其功能相关的不同活性位点：PLA2活性（S32）、过氧化物酶活性（C47）以及其它半胱氨酸残基（C91）（图4A）。作者对hPRDX6中的这些残基进行了定点突变，并使其稳定在PRDX6 KO HT-1080细胞中表达。尽管S32A和C91S突变体可以将GPX4和GPX1的表达水平恢复至野生型（WT）水平，但C47S突变体未能使GPX4的表达恢复（图4B）。此外，PRDX6 KO细胞对RSL3和erastin的铁死亡敏感性可以通过过表达PRDX6 WT、S32A和C91S来降低，但C47S突变体则没有（图4C和4D）。接下来，作者在硒缺乏的培养基中培养了不同PRDX6的突变体，只有PRDX6 KO 和C47S突变体的细胞死亡，额外补充硒源可以拯救细胞(图4E 4F). 这些数据表明，在硒缺乏下，PRDX6中的过氧化位点C47对有效的细胞内硒处理和以GPX4为代表的硒蛋白的表达从而保护细胞对抗ferroptosis，是必不可少的。
后续的相关实验证明PRDX6是硒受体蛋白 (selenium-acceptor protein)。
Prdx6-deficient mice exhibit lower selenoprotein expression in brain
接下来，为了研究了PRDX6在硒代谢的生理功能，作者分析了PRDX6缺乏的小鼠整个身体。然而，在正常的饮食条件下，PRDX6 KO小鼠脑部中GPX4和GPX1的表达要远低于WT小鼠。但在肝和肾的表达水平却相当（图7A）。这些结果表明在某些特定组织内，PRDX6在硒蛋白表达的重要作用。
PRDX6 deficiency suppresses tumor growth synergistically with ferroptosis inducers
为了进一步评估体内PRDX6耗竭的影响，作者使用皮下植入WT或PRDX6 KO人肺癌A549细胞到异种移植小鼠模型上。BALB/c裸体小鼠用对照或咪唑酮erastin（IKE）来处理，是一种代谢更稳定铁死亡诱导剂。经过IKE给药的PRDX6 KO小鼠肿瘤要比WT细胞的肿瘤体积更小(图7B and 7C)。在PRDX6 KO肿瘤中GPX4和GPX1的水平也很低(图7D)。因此，在体内移除PRDX6增加了肿瘤对铁死亡诱导剂的敏感性。
总结：本文研究结果表明PRDX6是铁死亡的一个重要调控蛋白。其作为硒受体蛋白，PRDX6有助于细胞内硒的高效利用，从而促进硒蛋白的生物合成，包括谷胱甘肽过氧化物酶4（GPX4）。PRDX6缺乏会降低小鼠大脑中GPX4的表达，增加肿瘤细胞对铁死亡的敏感性。
另一篇文章与本文以背靠背的形式同时发表在Molecular cell上。
温馨提示
简单操作即可星标⭐️医药速览，第一时间收到我们的推送
