西北农林科技大学：伪狂犬病毒UL4蛋白促进ASC依赖性炎症小体活化和细胞焦亡从而加剧炎症

伪狂犬病病毒（PRV）的非结构蛋白UL4显著促进了NLRP3炎症体的激活。通过在293T细胞中重建NLRP3炎症体系统并用LPS/NG刺激，结果显示UL4表达能显著增加IL-1β的分泌和NLRP3炎症体的激活。此外，UL4表达的3D4/21细胞和BMDMs在LPS/NG或LPS/ATP刺激下，成熟CASP1 (p10) 和IL-1β (p17) 蛋白的产生以及IL-1β和IL-18的分泌都有所增加。这些结果表明，UL4可能通过增强NLRP3炎症体的激活来促进IL-1β和IL-18的产生。

图1.PRV UL4 是 NLRP3 炎症小体激活的启动子

2.PRV UL4 还能增强 AIM2 炎症小体的激活

在研究中发现，伪狂犬病病毒（PRV）的非结构蛋白UL4不仅能增强NLRP3炎症体的激活，还对AIM2炎症体的激活有促进作用。通过在293T细胞中重建AIM2炎症体系统并过表达UL4，结果显示UL4显著提高了poly dA:dT刺激下IL-1β的分泌。此外，UL4的表达增加了CASP1 (p10) 和 IL-1β (p17) 蛋白的产生，而对Pro-IL-1β和pro-CASP1的表达没有影响。在BMDMs中，过表达UL4的细胞在Poly dA:dT处理下也分泌了更多的IL-1β和IL-18，并产生了更多的p10和p17。这些结果表明，PRV UL4蛋白除了增强NLRP3炎症体的激活外，也促进了AIM2炎症体的激活。

图2.PRV UL4 还促进 AIM2 炎症小体的活化

3.UL4 无效突变可减轻 PRV 感染细胞中的炎症小体活化

研究中构建了PRV UL4基因缺失突变株（PRV-ΔUL4），以探究UL4蛋白在PRV感染细胞中对炎症体激活的影响。结果显示，与野生型PRV感染相比，PRV-ΔUL4感染的细胞分泌的IL-1β和IL-18水平显著降低。此外，通过ELISA和西方印迹分析发现，缺失UL4的PRV感染细胞中成熟IL-1β (p17) 和CASP1 (p10) 的生成减少，而Pro-CASP1和Pro-IL-1β的表达未受影响。这些结果表明，UL4的缺失能够减轻PRV感染细胞中炎症体的激活及其介导的IL-1β和IL-18的产生。

图3.UL4 无效突变可减轻 PRV 感染细胞中的炎症小体活化

4.PRV UL4促进巨噬细胞焦亡

研究表明，伪狂犬病病毒（PRV）的UL4蛋白显著促进了巨噬细胞的焦亡。通过在3D4/21细胞系和骨髓来源的巨噬细胞（BMDMs）中过表达UL4蛋白，研究发现UL4能显著增强LPS/NG诱导的LDH释放，这是焦亡的一个标志。同时，UL4表达的细胞中GSDMD-NT（焦亡执行蛋白的N端片段）的量也增加，表明UL4促进了GSDMD的切割，这是焦亡过程中的一个关键步骤。相反，当PRV的UL4基因被敲除后，感染PRV-ΔUL4的细胞中LDH的释放和GSDMD-NT的产生都显著减少，证实了UL4在PRV感染巨噬细胞中促进焦亡的作用。

图4.病毒UL4蛋白促进巨噬细胞焦亡

5.UL4 与 ASC 结合

研究揭示了伪狂犬病病毒（PRV）UL4蛋白与ASC蛋白的相互作用。通过共免疫沉淀（Co-IP）实验，结果显示UL4仅与ASC发生相互作用，而与NLRP3或CASP1无交互作用。进一步的免疫共沉淀和共聚焦显微镜分析确认了UL4与ASC的结合，并发现UL4与ASC在细胞质中共定位，特别是在ASC形成环状结构时。此外，研究还发现UL4的132-145氨基酸序列是其与ASC结合的关键区域，这段序列的突变（UL4mut）会破坏UL4与ASC的相互作用。这些发现表明，UL4通过与ASC的结合来调节ASC依赖的炎症体激活，进而影响炎症反应。

图5.PRV UL4 与 ASC 相互作用

6.UL4 的 132aa–145 aa 允许其转位到细胞质中，与细胞质 ASC 相互作用，从而促进 NLRP3 和 AIM2 炎症小体活化

研究中发现，PRV UL4蛋白的132至145氨基酸序列（aa）是其从细胞核转移到细胞质中与ASC相互作用的关键区域。这个序列的突变（UL4mut）阻止了UL4与ASC的结合，并且影响了UL4促进NLRP3和AIM2炎症体激活的能力。具体来说，UL4的这一序列对于其从细胞核输出至细胞质中是必需的，在那里它能够与细胞质中的ASC相互作用，进而促进NLRP3和AIM2炎症体的激活。通过缺失或突变这个关键序列，UL4失去了促进炎症体激活和焦亡的能力，这表明UL4的这一区域对于其在PRV感染中调节宿主细胞炎症反应的功能至关重要。

图6.UL4 序列参与炎症小体激活

7.UL4 突变可减轻 PRV 感染细胞中的炎症小体活化和细胞焦亡

研究表明，PRV UL4基因的突变（PRV-UL4mut）能够减轻PRV感染细胞中的炎症体激活和焦亡。与野生型PRV（PRV-WT）感染相比，PRV-UL4mut感染的细胞分泌的促炎细胞因子IL-1β和IL-18水平显著降低。此外，突变株感染的细胞中成熟IL-1β (p17) 和CASP1 (p10) 的产生减少，表明UL4的突变影响了炎症体的激活。焦亡的生物标志物，如LDH的释放和GSDMD-NT的产生，在PRV-UL4mut感染的细胞中也有所降低。这些结果暗示UL4在PRV感染引起的炎症反应中起着关键作用，其功能的丧失可减轻炎症体激活和焦亡，为抗PRV治疗策略提供了潜在的靶点。

图7.UL4 突变可减轻 PRV 感染细胞中的炎症小体活化和细胞焦亡

8.PRV UL4 促进 ASC 寡聚化和斑点形成

研究证实，伪狂犬病病毒（PRV）的UL4蛋白能够显著促进ASC的寡聚化和斑点形成。在共转染实验中，与ASC共表达的UL4并没有影响NLRP3和ASC之间的相互作用，但增强了pro-CASP1与ASC之间的相互作用，表明UL4在ASC和NLRP3斑点形成之后发挥作用。实验观察到，过表达UL4的细胞中ASC斑点的形成明显增加，与ASC共聚焦显微镜分析显示，UL4能够促进ASC斑点的形成。此外，UL4的突变株（UL4mut）感染的细胞中ASC寡聚体的形成显著减少，与PRV-WT感染的细胞相比较。这些数据表明，UL4通过调节ASC的寡聚化和斑点形成，促进NLRP3炎症体的激活。

图8.PRV UL4 增强 ASC 寡聚化和斑点形成

9.PRV UL4 促进 ASC 磷酸化

研究表明，伪狂犬病病毒（PRV）的UL4蛋白能够促进ASC的磷酸化。具体来说，UL4表达的细胞中ASC在Y146位点的磷酸化水平显著增加，而UL4突变株（UL4mut）表达的细胞中这种磷酸化水平则降低。此外，UL4还能增强SYK和JNK的磷酸化水平，这两者已知可调节ASC的磷酸化。与PRV-WT感染的细胞相比，PRV-UL4mut感染的细胞中SYK和JNK的磷酸化水平较低。这些发现暗示UL4通过增强ASC的磷酸化，特别是通过促进SYK和JNK的活性，来促进ASC的寡聚化和炎症体的激活，从而在PRV感染引起的炎症反应中发挥关键作用。

图9.PRV UL4 蛋白通过促进 ASC 磷酸化促进 ASC 寡聚化和斑点形成

10.UL4 突变可减轻炎症并降低体内致病性

研究中发现，PRV UL4基因的突变（PRV-UL4mut）在体内能减轻炎症反应并降低病毒的致病性。在对小鼠和猪进行的实验中，与野生型PRV（PRV-WT）感染相比，感染PRV-UL4mut的动物表现出较低水平的血清和组织中的IL-1β和IL-18，这表明体内炎症反应得到了缓解。此外，感染PRV-UL4mut的动物肺部和脑部组织的病理损伤较轻，病毒载量在感染后期也有所降低。这些结果表明，UL4在PRV感染引起的炎症和组织损伤中起着重要作用，其功能的丧失可以减轻炎症反应，降低病毒的致病性，这为未来开发针对PRV的减毒疫苗或治疗策略提供了新的靶点。

图10.UL4 突变可减轻 PRV 感染猪的炎症

本研究深入探讨了伪狂犬病病毒（PRV）非结构蛋白UL4在调控宿主细胞炎症体激活和焦亡中的作用。研究发现，UL4蛋白通过与ASC蛋白相互作用，促进了NLRP3和AIM2炎症体的激活，进而加剧了炎症反应。此外，UL4蛋白的132至145氨基酸序列对其功能至关重要，该序列的突变显著减弱了UL4促进炎症体激活和焦亡的能力。

进一步的体内实验表明，UL4基因的突变能够减轻PRV感染引起的炎症和病理损伤，降低病毒的致病性。这些结果为理解PRV与宿主相互作用的分子机制提供了新见解，并为开发新的疫苗和治疗策略提供了潜在的靶点。

总的来说，这项研究揭示了PRV UL4蛋白在调节宿主免疫反应中的关键作用，强调了针对UL4的干预措施在控制PRV感染和减轻炎症损伤中的潜在价值。通过靶向UL4，未来可能会开发出更有效的疫苗和治疗方法，以对抗PRV和其他可能利用类似机制的病原体。

https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1012546

校对：Collin

投稿合作：shouyiyanquan@163.com

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