目前，大多数商业重组蛋白是使用细菌或真核细胞表达系统生产的，具体取决于获得功能性蛋白所需的结构复杂性和细胞依赖性修饰。大肠杆菌用于学术和工业规模的重组蛋白生产，不仅成本低廉且易于分批培养至高密度，而且已经开发了多种菌株、试剂、启动子和工具，以促进大肠杆菌中功能性蛋白的生产。重新编程细胞以将特定分子包装成离散膜包膜的能力是当今合成生物学和重组蛋白领域的主要挑战之一。因此，开发一种系统，允许从大肠杆菌中输出囊泡包装的蛋白质。此技术涉及简单的肽标签，不仅简化了后续的重组蛋白纯化，而且包装成膜囊泡的蛋白可应用于生物技术和医疗行业的内众多领域。
重组囊泡的形成
在大肠杆菌中表达人类的α-突触核蛋白(αSyn)会导致细胞外出现含有αSyn的膜囊泡，膜囊泡中含有膜蛋白OmpA。进一步分析表明，αSyn的α螺旋氨基末端的38个残基足以使大肠杆菌形成OmpA标记的细胞外膜结合囊泡，并释放到培养基中。体外分析表明，这种αSyn衍生的多肽(囊泡成核肽，VNp)，与重组大肠杆菌膜脂质组成的囊泡相互作用，随后稳定其α螺旋结构。荧光成像显微-荧光共振能量转移显示，VNp融合在胞内与内部大肠杆菌膜特异性结合，这个过程的发生不会影响细胞生长，并推动了细胞中囊泡的大规模生产，以支持从生长培养基中分离重组蛋白，以及从培养结束时收获的细胞中分离重组蛋白，从而大大节省了时间和资源。
编码VNp的序列与编码单体荧光蛋白mNeongreen的序列融合，导致VNp-mNeongreen蛋白囊泡的生产和输出到培养基中。通过动态光散射(DLS)分析，得到的vnp诱导的囊泡平均多分散指数大于1，说明囊泡在培养基中具有广泛的大小分布。1天大的和4个月大的囊泡之间的zeta电位(从峰值计算)没有显著差异，在3个月的时间里，囊泡中含有的VNp-mNeongreen没有明显的损失。因此，分离的囊泡为有效长期储存蛋白质提供了稳定的环境。通过分离囊泡的质谱蛋白质分析确定通过一步过滤收获的融合蛋白的纯度，发现足以用于非常广泛的应用，同时在必要时支持囊泡超声后的后续纯化。综上所述，这些数据支持了一个VNp融合与大肠杆菌膜相互作用的模型，并随后整合到囊泡中，释放到培养基中。
图1 重组囊泡形成
VNp可表达含二硫键的功能性IgG1融合二聚体
VNp融合高效地增强了每个靶蛋白的表达，并支持单个蛋白的表达，其大小范围从小于1 kDa到85 kDa，以及蛋白质复合物。VNp融合提高了所检测的每个目标蛋白的总体产量。虽然添加mNeongreen标签可以增强溶解性促红细胞生成素(EPO)、依那西普和人类生长激素(hGH)的表达，但添加25 kDa的mNeongreen荧光蛋白标签导致所检测的每种模型治疗蛋白的总产量降低。可能是由于蛋白质大小的总体增加以及mNeongreen对细菌细胞生长的不同负面影响导致的。此外，观察到表达不同VNp融合物的培养中，VNp诱导的囊泡大小或丰度存在显著差，丰度的差异可能是由于囊泡内表达和包装效率导致的。
VNp 融合允许产生不溶或降低细菌细胞活力的可溶性蛋白质。对于含二硫键的蛋白质依那西普和hGH，大部分可溶性重组蛋白保留在细胞内。电镜数据显示，将VNp-mNG与依那西普融合，影响内膜的VNp重塑，诱导含有VNp融合的内化细胞质膜结构。依那西普是一种由肿瘤坏死因子和免疫球蛋白G1(IgG1)融合组成的抗炎疗法。这种肿瘤坏死因子(TNF)-IgG1治疗性融合不仅是二聚体(二硫键依赖性)，而且当从VNp诱导的胞质囊泡中分离时，也表现出适当的配体结合特性。通过TEV蛋白酶依赖的蛋白水解去除VNp-mNeongreen融合后，结合蛋白A的能力得以维持。同样，VNp-mNG-TEV-DARP和VNp-mNG-TEV-尿酸酶对VNp-mNG 的蛋白水解切割不会影响DARP或尿酸酶的溶解度，表明VNp一旦表达就不需要保持溶解度。
图2 VNp可表达含二硫键的功能性IgG1融合二聚体
为了探索二聚化是否足以诱导VNp融合蛋白的内化，通过引入亮氨酸拉链(LZ)序列来产生稳定的α螺旋。VNp-LZ融合表达诱导了胞质VNp-LZ融合填充囊泡结构的形成，该囊泡结构由含有CydAB的内膜形成。虽然确切的分子基础尚不清楚，但这些数据表明，二聚化VNp融合促进细菌膜向内弯曲，而不是向外弯曲，为在胞质膜结合结构内生成重组蛋白提供了一种有吸引力的方法，从而促进大肠杆菌产生含二硫化物键和其他不溶性或有毒的蛋白质。
图3 VNp二聚体产生含有VNp融合的细胞膜包
原文链接：
https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S2667237523000036?via%3Dihub
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摘译 | 张思琪
编辑 | 王咏桐
左莎莎
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