D-阿洛酮糖（D-Allulose）是一种天然稀有的六碳糖，在蔬菜和水果中以极低含量存在。由于D-阿洛酮糖热量低并且甜度接近蔗糖70%，故是一种优质的甜味剂。酶促催化法是生产D-阿洛酮糖的常用方法，具有较高的底物转化率、较快的反应速率以及便于产品纯化等优势。然而，酶的生产和固定化带来了较高的经济成本。相比之下，微生物发酵法可能是一种有前途的替代方案，它可以将酶的生产和D-阿洛酮糖的合成结合在同一个生物反应器中进行，减少成本并简化生产过程。因此，该研究基于以上背景，开发了一株能够利用木糖和甲醇混合物的大肠杆菌工程菌株，用于D-阿洛酮糖的绿色高效合成。
图1 D-木糖-甲醇混合物生产D-阿洛酮糖的细胞工厂代谢途径图
调节碳代谢促进D-阿洛酮糖的合成
核酮糖-5-P是合成D-阿洛酮糖的重要前体。为了在不影响磷酸戊糖途径的情况下提高D-阿洛酮糖的产量，作者首先设计了一种带有稳定发卡结构的反义RNA来干扰 RpiB的表达。对比了三个不同长度的发卡环（50、100和200 bp），并将这些反义RNA基因分别插入到质粒pRSF-SAA中，然后将这些质粒转化到LMM菌株中，得到LMM asRNA50、LMM asRNA100和LMM asRNA200菌株。结果表明，LMM asRNA200的D-阿洛酮糖产量最高，达到0.631 mM/mM。然而，过度干扰RpiB表达对细胞生长有害，导致木糖消耗和D-阿洛酮糖滴度降低。当反义RNA的发卡环长度缩短至100 nt时，D-阿洛酮糖产量为0.570 mM/mM，而细胞密度仅下降18.9%。故该研究选择LMM asRNA100菌株为后续研究的宿主。
为了进一步减少副产物积累，该研究敲除了galE基因，该基因表达一个能催化几种己糖之间的差向异构化的酶。结果显示，D-阿洛酮糖的产量提高到0.623 mM/mM。
图2 通过控制碳通量提高D-阿洛酮糖产率
自诱导解毒的翻译控制系统设计
前期研究中作者通过敲除了FrmRAB来阻止甲醛被氧化为甲酸，避免了甲醇的浪费。然而，这一定程度上增加了甲醇对菌株的毒性。为了解决这一问题，作者计划将 frmRAB 基因重新引入 LMM asRNA100G菌株，并使用基于反义RNA-OUT（A01）和正义RNA-IN（S01）的翻译控制系统对其动态调控。在这个系统中，A01由D-木糖依赖的启动子Pxyl调控，S01-SD-frmRAB则由组成型启动子Pdc调控。当发酵液中存在D-木糖时，细胞会生成 A01 mRNA，A01与S01mRNA 结合，阻止frmRAB mRNA的翻译。而当D-木糖耗尽时，Pxyl启动子关闭，SD序列暴露并与核糖体结合，从而开始表达FrmRAB，实现自感应解毒。
首先，作者使用荧光蛋白分析了Pxyl和Pdc启动子的功能和强度。结果表明Pxyl和Pdc都具有转录功能，并且插入S01并不影响目标基因的转录和翻译。此外，Pxyl控制的GFP荧光强度明显高于Pdc控制的GFP，表明当系统被D-木糖诱导时，A01的表达可能比 S01 更强，这有助于抑制FrmRAB的翻译。作者基于上述原理构建了两个工程菌株：S01FG（含S01而含A01）和AS01FG（同时含有S01和A01），并测试了不同浓度D-木糖对FrmRAB-GFP表达的抑制效果。结果显示，在含有不同浓度D-木糖的LB培养基中，AS01FG的荧光信号几乎检测不到。
图3 自感应解毒逻辑开关的研制
自诱导解毒技术在D-阿洛酮糖绿色生产中的应用
作者构建了AS01FX菌株，其中共表达了Mdh（将甲醇转化为甲醛）和A01-S01-FrmRAB（用于动态调控甲醛解毒），并敲除了基因组中的frmRAB和xylA基因(确保木糖不被消耗并持续诱导Pxyl启动子)。结果表明，在没有D-木糖的条件下，甲醇消耗速率为1.783 mM/h，表明解毒途径处于开启状态；而在添加D-木糖后，甲醇消耗速率降低至0.767 mM/h。这是由于D-木糖正确诱导了A01基因的转录并关闭了菌株的解毒功能。
随后，作者进一步将上述策略引入LMM asRNA100G菌株中，并在含有51.4 mM D-木糖和98.4 mM甲醇的LB培养基中进行两相发酵。0-60小时(D-阿洛酮糖生产阶段)：耗尽木糖，D-阿洛酮糖的滴度为33.2 mM，甲醇剩余39.9 mM；60小时后(甲醇解毒阶段)：解毒途径激活，甲醇被进一步消耗。作者利用qPCR验证A01和frmRAB的表达量，结果显示在D-木糖耗尽后，A01的表达量显著减少，frmRAB的翻译被启动，表明自诱导元件正确运行。
图4 自诱导解毒的功能分析
图5 自诱导解毒技术在D-阿洛酮糖绿色生产中的应用效果
通过分批补料发酵提高产量
在3升发酵罐中进行补料分批发酵，通过使用富含色氨酸和酵母提取物的SB培养基和自动调节的磷酸和氨水来保持pH值为7.0，提供足够的营养。甲醇浓度被控制在100 mM以下，以减轻甲醛积累对细胞生长的负面影响。
96小时后，D-阿洛酮糖的滴度达到了98.6 mM，基于D-木糖的产率为0.615 mM/mM，基于甲醇的产率为0.461 mM/mM，细胞密度为3.76，比摇瓶发酵提高了2.63倍，生产率达到0.969 mM/h (显著高于摇瓶发酵的0.553 mM/h)。在发酵后期，自感应解毒系统启动，甲醇在132小时被完全消耗，避免了甲醇残留，实现了D-阿洛酮糖的绿色生产。
图6 D-阿洛酮糖的分批补料发酵生产
原文链接：
https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acs.jafc.4c03219
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摘译 | 赵逸飞
编辑 | 王咏桐
左莎莎
陈嘉序
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