微生物的代谢重组是合成有价值的天然萜烯的一种经济和可持续的策略。萜烯是最大的一类自然衍生的特殊代谢物，许多具有宝贵的药物或生物活性。角鲨烯是一种药用萜烯，可作为疫苗佐剂，提高包括COVID-19疫苗在内的疫苗的有效性，并作为抗氧化剂和抗癌剂发挥多种生物学作用。然而，代谢重新布线干扰固有的代谢途径，通常以一种损害细胞生长和微生物宿主健康的方式。而乙酰辅酶a作为产生包合成括角鲨烯在内的各种化合物的关键起始分子前体，参与了许多严格调控的生物过程，以维持代谢稳态，这限制了代谢通量向所需产物的重定向。
通过MVA途径的代谢通量受到途径中间体或下游产物的反馈调节。因此作者在基于团队开发的用于萜烯生产的酵母生物合成平台SQ00菌株中过表达了tHMG1基因，该基因编码HMG1的催化结构域，旨在增加萜烯产量的菌株SQ00包含Erg20的过表达，以及内质网(ER)的扩张，通过过表达内质网大小调节因子(Ino2)来进行萜烯合成途径的功能组装。结果表明：经过144小时的发酵，角鲨烯的产量从11.10 mg/L到550.89 mg/L。
图1 酵母高水平生产角鲨烯的代谢重组
随后，作者利用定量PCR分析研究整合tHMG1基因的拷贝数(图2A)。角鲨烯产生滴度大于500 mg/L的转化子含有4个tHMG1基因拷贝。此外，随着tHMG1基因拷贝数的增加，其转录水平逐渐增加至4拷贝，但随着拷贝数的进一步增加，转录水平反而下降(图2B)。这一观察结果表明，在一定的拷贝数水平下，整合tHMG1基因的拷贝数确实与其表达和角鲨烯生产滴度呈正相关。因此，在这些菌株中，作者选择了角鲨烯滴度最高的菌株(550.89 mg/L)和tHMG1表达量最高的菌株(4个拷贝)，称为SQ4t菌株，其角鲨烯滴度比对照菌株SQ00(4.14 mg/L)高出近133倍。其次，为了进一步提高SQ4t菌株的角鲨烯产量，作者调节了麦角甾醇的生物合成途径，将角鲨烯转化为麦角甾醇(图1)。尽管如先前报道的那样，通过添加抑制剂特比萘芬部分抑制Erg1活性对角鲨烯积累有效，但随着特比萘芬浓度的增加，细胞生长和角鲨烯滴度明显降低(图2C)。此外，特比萘芬是一种高度亲脂性的补充剂，很难通过下游提纯过程去除角鲨烯。
图2 工程酵母菌株的角鲨烯产量
接下来，为了进一步明确乙酰辅酶a供应对TAG降解的影响，作者对工程菌株中的TAG水平进行了量化。结果表明：在72 h时，TAG水平下降了47%(图3B)。在SQ4td-TGL3菌株培养24-72 h时，TAG的解脂效果保持不变。与TAG水平降低一致，菌株SQ4td-TGL3与SQ4td菌株(12.7个LD/细胞，平均直径0.58µm，体积1.60µm3)相比，LD数量减少了39%，LD的平均直径(Davg~0.58µm)没有显著差异，导致每个细胞的LD总体积(0.91µm3)减少了43%(图3C, D)。
图3 LD代谢工程菌株中由TAG降解驱动的乙酰辅酶a供应
由于许多萜类化合物在发酵过程中滴度增加，因此在料批发酵过程中通常使用乙醇作为主要碳源。甘油是酵母的另一个潜在来源，因为与其他糖相比，甘油的碳还原状态更高。然而，葡萄糖仍然是工业萜烯生产中广泛使用的碳源。因此，作者测试了三种不同的碳源，以确定哪种碳源最适合生产角鲨烯。最佳菌株SQ4td-TGL3在以葡萄糖、甘油或乙醇(2%)为碳源的摇瓶中培养，葡萄糖作为唯一碳源，培养144 h后产生的角鲨烯滴度最高，为862.62 mg/L。
把菌株SQ4td-TGL3在含葡萄糖的复合培养基中培养时，培养144 h后，其角鲨烯滴度比在规定的培养基中提高了26% (1024.88 mg/L)。最后，在5 L的生物反应器中，在以葡萄糖为碳源的复合培养基中，最终生产滴度达到了6.53 g/L(图4)。
图4 角鲨烯高产菌株SQ4td-TGL3补料分批发酵
原文链接：
https://doi.org/10.1186/s13068-022-02208-9
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摘译 | 左莎莎
编辑 | 王咏桐
左莎莎
陈嘉序
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