重新讲一下目前应用比较稳定的设计引物的方法
以人的β-actin基因为例尽量详细的介绍目前设计QPCR引物的方法
查找基因
Actin基因的基本信息如下
找到mRNA序列，注意正常设计引物一般以NM号开头的为准，XM多数为用生物信息学的方法预测的到的转录本信息。Actin只有一个NM号
正常Qpcr设计引物尽量设计在CDS区，actin的CDS信息为193-1320
点击右侧的Pick Primers
如果需要引物设计在CDS区则把相应的选定范围标注在相应的选择框内，如下图：
正常QPCR引物一般设计小于200，我个人一般习惯100-200之间。红色标注为扩增产物大小，蓝色圈出为设计的引物数量
一般情况下QPCR引物尽量选择跨外显子设计这样可以避免因为提取RNA过程中基因组DNA没有去除干净引起的非特异扩增的产生。红色标注为选择必须扩外显子设计。
另外还需选择比对的数据库以及种属，因为之前是从mRNA的界面直接进入的设计引物界面，所以该部分默认的与之前mRNA 的界面一致。
点击get primers，另外个人比较习惯让设计的引物显示在新的页面中，所以可勾选Show results in a newwindow选项，这样如果前面有选项错误可重新选择。
热腾腾的引物就这么出来了，下图显示的是该序列的整体信息及引物在整个序列中的位置
下面显示的就是第一对引物的详细信息。一般引物本事比较需要关注的就是红色标记的几个值尽量小于4，蓝色标记为引物跨的外显子的位置，这里边反应的是引物主观上的好坏
下图为该对引物比对到的相关的非特异的其他的一些序列，需要注意比对到的非特异序列，这里反应的是引物在整个数据库中的客观的好坏。
引物的选择要综合考虑引物的自身主观的质量和客观特异性最终做出选择。
根据不同的实验要求对引物也有不同的要求，当然最终评价引物好坏还是要以最终的实验结果为准。
检测文献中的引物是否合适
打开NCBI中的Primer Blast程序，
以我们之前验证过的一对小鼠的GAPDH的引物序列进行演示
输入想要验证的引物序列，选择对应的数据库，如果研究的是编码蛋白的数据库就选择mRNA数据库，如果研究的是非编码RNA就选择nr数据库，如果是chip引物选择基因组数据库，记得不要选错！然后get primer。
在比对完的结果中可以看到引物自身的相关信息，比对到的目的基因信息，扩增的目的基因长度，在目的基因中不同转录本中的位置等信息。关于引物的好坏的信息可以参考前半部分。
如果拿着小鼠的引物在人的数据库比对结果是什么样的呢？反面典型结果来了
引物自身参数部分是一样的，比对到的也是人的GAPDH基因，不过不能跟人的序列完全匹配。
悄悄的跟大家说一下，文献中有好多引物都惨不忍睹，扩增长度辣眼，特异性没法看，这都不是下限，有的文献里种属和基因都不对还标的光明磊落，总之用文献中的序列也要慎重，最好自己做一下比对避免掉坑里。要是审稿人给一些文章blast一些引物，不知道会不会直接拒稿？引物都不对，后边的数据怎么能可靠，切莫因小失大
