兰大雷新响团队: 快速高效简单构建噬菌体展示功能大环肽库
环肽具有重要的生物学功能，为发现针对具有挑战性的靶标和蛋白质-蛋白质相互作用的功能分子提供了重要来源。该领域的研究趋向于开发各种环化策略和化学修饰组合文库，结合展示技术以开发传统上具有挑战性的靶点的大环肽抑制剂。 近日，兰州大学雷新响教授
邻苯二醛 (OPA) 是一种多功能的生物正交交联剂，可在温和的生理条件下（PBS 7.4，rt，20 min）与氨基及巯基进行快速的环化反应，生成一个具有异吲哚骨架的环肽。研究团队将该特性结合到噬菌体展示技术中，开发了一个与 OPA 环化兼容的噬菌体展示平台（图 2C）。探究该反应是否能在噬菌体上顺利进行，作者首先在 M13 噬菌体 pIII 外壳蛋白的 N 端编码了一个定义的肽序列 (KGGSC)，随后集成了一个 Factor Xa 识别位点。通过酶切、还原和 CBT 封闭等步骤，作者成功地在噬菌体表面展示了线性前体肽。然后向噬菌体溶液（pH 7.4）中加入 0.3 mM 的 OPA，室温反应 20 分钟即可得到所需环肽。此外，作者还在肽序列与 pIII 蛋白之间策略性地插入了 TEV 切割位点，通过 TEV 消化并随后通过 HR-ESI-MS 分析，确认了目标环肽生成（图 2B）。作者还通过测定噬菌体滴度来探究了连接子的最佳反应浓度，结果表明 OPA 浓度为 0.3 mM 是构建环肽文库并保持噬菌体活性的最佳浓度（图 2D），为后续筛选实验奠定了基础。 在验证该环化策略在噬菌体上的可行性后，作者使用构建的 KX7C 环肽库针对蛋白酪氨酸磷酸酶 1B (PTP1B)、NIMA 相关激酶 7 (NEK7) 和人 Kelch 样 ECH 相关蛋白 1 (hKeap1) 三个与人类疾病治疗相关的蛋白质进行筛选。
PTP1B（蛋白酪氨酸磷酸酶 1B）是一种胞内 PTP，与酪氨酸磷酸激酶（PTK）相互作用，对胰岛素转导进行负调节,是II型糖尿病及肥胖症治疗靶点。经过四轮淘选及肽序列解码，作者得到了几条富集度较高的肽序列（图 3C），作者将淘选出来的环肽与线性肽进行比较，发现与线性前体（9.2±0.9 μM）相比，环肽的亲和力可以提高近五倍（1.9±0.3 μM）(图3D)。该结果表明了肽环化对于提高亲和力的重要作用。 图 3. 靶向 PTPIB 环肽抑制剂的筛选及 BLI 测定 为了揭示筛选的环肽所占据的活性口袋，作者利用 PTP1B 晶体结构进行了分子对接研究和分子动力学模拟。结果显示该环肽主要占据 PTPIB 的 B、C 活性口袋并主要与 His 25、Ala 27、Asp 29、Asp 48 残基相互作用（图4C）。为验证分子对接及动力学模拟结果的可靠性，作者将主要发挥亲和作用的氨基酸残基进行丙氨酸突变后再进行结合亲和力测试，发现突变后的 PTPIB(Ala)与环肽之间的亲和力降低了 13 倍（25.3±3.9 μM）（图4B）。进一步的体外酶抑制实验显示，M1_OPA 对 PTP1B 的去磷酸化功能具有一定的抑制作用，其 IC50 值为 10.43 ± 1.06 μM，进一步揭示了环肽与 PTP1B 结合从而抑制去磷酸化的机制。
图 4. M1_OPA 与 PTP1B 结合的相互作用模式的确认 此外，作者还针对另外两种治疗相关蛋白质（NEK7和hKeap1）进行了筛选，均富集到了不同程度的肽序列（图5B、6D）。其中，N1_OPA 与 NEK7 表现出最佳的结合活性,其 Kd 值为 2.1 ± 0.2 μM(图5D); Hk1_OPA 表现出最佳的结合活性,其 Kd 值为 4.3 ± 0.5 μM(图6D)。
图 5. 靶向 NEK7 环肽抑制剂的筛选及 BLI 测定
图 6. 靶向 hKeap1 环肽抑制剂的筛选及 BLI 测定 总之，该研究团队成功地将 OPA 环化策略整合到噬菌体展示技术中，为功能大环肽的筛选提供了一个快速、高效、可操作的高通量平台，在治疗学、化学探针和疾病诊断中具有广泛的应用前景。该成果以 “ A facile strategy for the construction of a phage display cyclic peptide library for the selection of functional macrocycles ”( 《一种用于构建噬菌体展示功能大环肽库的简单策略》 )为题，发表在英国皇家化学会期刊 Chemical Science 上。
A facile strategy for the construction of a phage display cyclic peptide library for the selection of functional macrocycles Hua Xiang, Liwen Bai, Xindan Zhang, Ting Dan, Peng Cheng, Xiaoqin Yang, Honglian Ai, Kai Li and Xinxiang Lei* （雷新响 ，兰州大学） Chem. Sci. 15 , 11847-11855/10.1039/D4SC03207A 本文共同第一作者，中南民族大学硕士，目前考入兰州大学继续攻读博士学位。
本文共同第一作者，中南民族大学和西北农林科技大学联合培养博士研究生。
本文通讯作者，博士生导师，药物化学专业，博士，现为兰州大学萃英特聘三级教授。毕业于中国科学院成都生物研究所，曾于 2010-2011 年在耶鲁大学从事 mRNA 与蛋白质相互作用研究工作。从事核磁共振波谱技术的天然产物结构鉴定、活性筛选，环肽药学化学生物学研究工作，开发了“液晶介质辅助”的有机分子核磁共振(NMR)三维结构分析方法，在 NMR 各向异性参数残留偶极耦合(RDC)构建有机分子原子分辨率的三维结构方面的研究处于国际领先地位。以通讯作者在 JACS，Angew. Chem. Int. Ed., Chem. Sci., ACS Nano, ACS Cata., Anal. Chem., Org. Lett., Chem. Commun. 等期刊上发表系列 SCI 论文。申请发明专利 4 件，参编英国皇家化学会 (Royal Society of Chemistry, RSC) 出版的学术专著《Residual Dipolar Couplings: Principles and Applications》。任中国化学会有机分析专业委员会委员, Magn. Reson. Chem., Nat. Prod. Bioprospect., Magn. Reson. Lett. 专业期刊编委。组织了多次国际学术会议，在全国性和国际性学术会议上做报告 40 余次，被 Nature，Angew. Chem. Int. Ed., Nature Commun. 等期刊邀请为审稿人。 Home to exceptional research and thought-provoking ideas. Open and free, for authors and readers. 2-年影响因子* 7.6 分 5-年影响因子* 8.0 分 JCR 分区* Q1 化学-综合 CiteScore 分† 14.4 分 中位一审周期‡ 33 天
Chemical Science 是涵盖化学科学各领域的跨学科综合性期刊，也是英国皇家化学会的旗舰期刊。所发表的论文不仅要在相应的领域内具有重大意义，而且还应能引起化学科学其它领域的读者的广泛兴趣。所发表的论文应包含重大进展、概念上的创新与进步或者是对领域发展的真知灼见。发文范围包括但不限于有机化学、无机化学、物理化学、材料科学、纳米科学、催化、化学生物学、分析化学、超分子化学、理论化学、计算化学、绿色化学、能源与环境化学等。作为一本钻石开放获取的期刊，读者可以免费获取所发表论文的全文，同时从该刊的论文版面费由英国皇家化学会承担，论文作者无需付费。
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