NC | 查尔姆斯理工大学Nielsen教授团队/中国中医科学院黄璐琦院士团队利用酵母代谢工程重新生产原小檗碱和苯并苯胺生物碱

原小檗碱和苯并苯胺生物碱（BZDAs）是两类具有抗菌特性的天然产物，由于其生物活性和对微生物和病毒的安全性而引起了越来越多的关注。原小檗碱和BZDAs属于苄基异喹啉生物碱（BIAS）家族，以其药理学特性而闻名。尽管可以从植物中分离BIAS，但通过大规模植物培养来满足日益增长的需求具有挑战性。而微生物生物合成能可靠、可扩展地供应BIAS。

为了实现 (S)-去甲乌药碱（(S)-NOR）的高效生产，作者首先筛选了5种酪氨酸羟化酶用于多巴胺生物合成。其中，CYP76AD5基因的引入导致多巴胺的产量最高（菌株XJ001）。接下来，作者比较了7种去氯嘌呤合成酶（NCS），以优化 (S)-NOR生物合成。此外，作者分别在CjNCS的N端截断了24、29和35个氨基酸，生产CjNCS∆24、CjNCS∆29和CjNCS∆35。在产生多巴胺的菌株XJ001中比较了以上NCS，其中CjNCS∆35产生最高的 (S)-NOR滴度。随后，作者通过过表达酵母内源性ARO1、ARO2、ARO3、ARO4^K229L和ARO7^G141S，大肠杆菌来源的EcaroL，紫花苜蓿来源的MtPDH1以增加酪氨酸生物合成的通量，构建了菌株XJ023。同时，在菌株XJ023中引入最优酶CYP76AD5、DODC和CjNCS∆35，获得菌株XJ053产生23.4 mg/L (S)-NOR。

然而，在菌株XJ053中检测到大量的多巴胺、4-羟基苯基乙酸（4-HPAC）和酪醇的积累，表明大部分4-羟基苯醛（4-HPAA）的碳通量流向了副产物。作者通过单独/组合敲除ARI1、ADH6、YPR1、YDR541C、AAD3、GRE2和HFD1减少4-HPAA的竞争。与菌株XJ058相比，以上7个基因的破坏略微增加了 (S)-NOR产量（菌株XJ059），但生物量明显下降。为评估CjNCSΔ35的表达水平是否受到限制，在菌株XJ058引入更多的CjNCSΔ35拷贝。新增2个CjNCSΔ35拷贝（菌株XJ063）使 (S)-NOR滴度达到214.8 mg/L，较菌株XJ058提高2倍。而进一步整合更多拷贝并没有增加 (S)-NOR滴度。为了进一步提高4-HPAA的可用性，作者比较了4种芳香氨基酸脱羧酶（AAAD），其中含PsAAAD*的菌株XJ0633产量最高（295.5 mg/L），较菌株XJ063提高38%。

为了进一步促进酪氨酸生物合成，作者在TYR1缺失菌株中检测了3个芳香脱氢酶（ADH）4个PPA转氨酶（ADH）。PAT和ADH的五种组合（AtPAT和BvADHα、AtPAT和MtncADH、BvPAT1和BvADHα、BvPAT1和MtncADH、BvPAT2和MtncADH）恢复了TYR1缺陷菌株的生长。然后，将以上5种组合分别引入到表达PsAAAD*的菌株XJ0633中，AtPAT和MtncADH组合（菌株XJ0636）的 (S)-NOR滴度提升至315.9 mg/L。因此，菌株XJ0636被选作后续实验的 (S)-NOR产生平台菌株。

图1  酵母中 (S)-NOR生产的优化

在6-O-甲基转移酶（6OMT）、可氯灵碱N-甲基转移酶（CNMT）、N-甲基可氯灵3'-羟化酶（NMCH）和4'-O-甲基转移酶（4'OMT）的催化下，(S)-NOR转化为 (S)-牛心果碱（(S)-RET）。为确定前三个步骤的最佳酶组合，作者在菌株XJ040（该菌株含有来自P. somniferum的PsCPR和Ps4'OMT）中测试了Ps6OMT、PsCNMT、EcNMCH（来自Eschscholzia californica），以及Cy6OMT、CyCNMT和CyNMCH（来自C. yanhusuo）。Ps6OMT、PsCNMT和CyNMCH的组合产生了最高的 (S)-RET。当反向表达模块II酶的第二拷贝时，只有过表达的CyNMCH的 (S)-RET滴度显著增加，表明NMCH催化的羟基化反应是主要的限速步骤。

为提高CyNMCH的效率，作者探索了不同的CPR。在菌株XJ0636中将ATR1或ATR2（来自A. thaliana）与其他四种最佳酶（Ps6OMT、PsCNMT、CyNMCH和Ps4'OMT）组合表达以合成 (S)-RET进行了比较。与PsCPR（菌株XJ0662，222.3 mg/L）相比，ATR1（菌株XJ0675，273.6 mg/L）和ATR2（菌株XJ0676，255.7 mg/L）都使 (S)-RET滴度改善，表明ATR1/2与CyNMCH的组合更好。然而，在菌株XJ0675中观察到中间体3'羟基-N-甲基椰糖啉和 (S)-N-甲基椰糖碱显著积累。因此，作者利用着陆点系统进行精确的多拷贝基因整合，增加菌株XJ0675中CyNMCH和Ps4'OMT的拷贝数。含有2个Ps4'OMT拷贝和5个CyNMCH拷贝的菌株XJ0691，产生425.2 mg/L (S)-RET，较对照菌株XJ0675增加了85%。

图2  将生物合成途径从 (S)-NOR扩展到产生 (S)-RET

微调BBE以提高 (S)-金黄紫堇碱滴度

在BBE的催化下，(S)-RET的N-甲基部分氧化环化成 (S)-金黄紫堇碱（(S)-SCO）的小檗碱桥，该化合物是原小檗碱和BZDAs生物合成的主要分支中间体。为获得合适的酶，作者在 (S)-RET产生菌株XJ048中比较了4种BBE。其中CyBBE显示出最高的活性。然而，(S)-RET在菌株中大量积累，表明 (S)-RET转换效率需进一步提高。

作者推测液泡的酸性环境导致BBE的活性降低。为了在胞质溶胶中表达CyBBE，N端截断以产生两个变体CyBBE∆29和CyBBE∆46，分别去除预测的ER靶向信号，或去除ER靶向信号和液泡分选信号。此外，还通过删除液泡信号但保留ER信号构建了CyBBE29Δ46。然而，所有三种CyBBE变体都导致了没有 (S)-SCO产生，表明此类截断影响了其正确表达或正确折叠。考虑到这两种信号对CyBBE的重要性，作者尝试将CyBBE从高尔基体逆行到内质网或将其保留在高尔基体中。使用ERC端HDEL肽（CyBBE_ERTS）来模拟ER管腔可溶性蛋白，或N端118个氨基酸的高尔基靶向序列（GOTS_CyBBE）来模拟II型高尔基整合膜蛋白，并在 (S)-RET平台菌株XJ0691中检测了两种变体。与野生型CyBBE相比，GOTS_CyBBE和CyBBE_ERTS分别使 (S)-SCO产量提高了33%和206%。

虽然CyBBE_ERTS使 (S)-SCO滴度达76.5 mg/L（菌株XJ0695），但 (S)-RET仍大量存在，表明此步骤仍然存在局限性。作者推测是由于过氧化氢（H₂O₂）的产生抑制了BBE活性。为了解决这些问题，作者测试了基于哺乳动物的过氧化物还蛋白IV（PRDX4），构建了具有N端信号序列和C端ERTS的α-mPRDX4_ERTS，它可以将蛋白质氧化折叠产生的电子转移到H₂O₂，从而产生H2O。α-mPRDX4_ERTS表达将 (S)-SCO滴度提高至98.4 mg/L，比对照菌株XJ0695高30%，表明H2O2是的毒性是影响CyBBE_ERTS活性的关键原因之一。最后，作者通过ER区室化策略提高了BBE活性，并通过缺失OPI1介导ER扩增，使 (S)-RET转化增加了36%。通过表达哺乳动物源性PRDX4进一步减轻副产物H2O2的反馈抑制导致 (S)-RET转化增加了30%。综合以上方法，最终菌株XJ0843的 (S)-SCO滴度达113.1 mg/L。

酵母中原小檗碱生物碱的从头合成

掌叶防已碱和小檗碱均属于原小檗碱生物碱。掌叶防已碱的生物合成由 (S)-SCO经过三步反应生成，分别是：胭脂虫碱9-O-甲基转移酶（S9OMT）、秋水仙碱O-甲基转移酶（CoOMT）和四氢小檗碱氧化酶。作者首先在遗传背景简单菌株XJ083中，筛选最佳的甲基转移酶。双功能甲基转移酶CySOMT直接将 (S)-SCO转化为 (S)-四氢巴马汀（(S)-THP），该酶将 (S)-SCO转化为 (S)- 四氢乌头胺（(S)-THC）的活性低于TfS9OMT*，但催化 (S)-THP产生的活性与CjCoOMT相当。随后，作者将TfS9OMT*和CySOMT分别与GOTS_CyBBE、CyBBE_ERTS或野生型CyBBE结合转化到 (S)-RET产生平台菌株XJ0691。含有CyBBE_ERTS、TfS9OMT*、CySOMT和OPI1缺失的衍生菌株XJ0839产生最高的 (S)-THP，为68.6 mg/L。加热可增强四氢原小檗碱到相应的季原小檗碱的转化。作者测试了在98°C下加热菌株XJ0839摇瓶发酵培养物，加热36小时后，获得54.0 mg/L的掌叶防已碱，转化效率为86%。

(S)-SCO经S9OMT、金雀花碱合成酶（CAS）和四氢原小檗碱氧化酶的催化，转化为小檗碱。将TfS9OMT*和CjCAS（来自C. japonica）引入菌株XJ0796中，产生的菌株XJ0834，产生23.2 mg/L (S)-四氢小檗碱。随后，作者通过在98°C下加热促进 (S)-四氢小檗碱转化为小檗碱。菌株XJ0834培养物加热36小时后，小檗碱产量达16.9 mg/L。

图4  扩展模块IV中掌叶防已碱和模块V中小檗碱的生物合成途径

酵母中苯并菲啶类物碱的从头合成

从 (S)-SCO转化为血根碱，依次由螯合呫吨啉合成酶（CFS）、苯乙烯合成酶（SPS）、四氢小檗碱N-合酶（CFS）、苯胺合成酶（SPS）、四氢小檗碱N-甲基转移酶（TNMT）、甲基苯胺14-羟化酶（MSH）、原碱6-羟化酶（P6H）和DBOX催化。为了使以上转化更容易重构，作者首先扩展了下游途径以生产中间的原阿片碱。在 (S)-SCO产生菌株XJ0695中，来自E. californica和C. yanhusuo的CFS和SPS，分别与PsTNMT和PsMSH（来自P. somniferum）共表达，其中EcCFS和EcSPS的酶组合表现出最佳活性。

研究报道，酵母通过自发转化或未知酵母菌天然酶催化产生微量二氢血根碱，这种反应可以由黄素蛋白氧化酶催化。因此，作者引入6种STOX。即使在只表达EcP6H的对照菌株中，所有转化子都产生了血根碱。然而，表达McDBOX2的菌株XJ0750的发酵产物中，未检测到二氢血根碱，作者推断McDBOX2在将二氢血根碱转化为血根碱方面具有功能。随后，将EcP6H、McP6H或CyP6H与McDBOX2联合使用，所得菌株都可以产生血根碱，其中EcP6H表现出最佳性能。

二氢血根碱转化为白屈菜宾需要3种酶，分别是P450羟化酶、O-甲基转移酶和黄素蛋白氧化酶。在产生含有McDBOX2的血红碱菌株XJ0822中表达了三个P450酶。仅CYP82P2可催化二氢血根碱生成10-羟基二氢血根碱，然后通过McDBOX2催化氧化生成10-羟基血根碱。随后，在菌株XJ0832中表征了两种O-甲基转移酶Ec2OMT和Ec11OMT（来自E. californica）以及CYP82P2。仅在表达CYP82P2和Ec11OMT的菌株中检测到白屈菜宾的合成。

作者通过进一步引入TfS9OMT*、CAS、PsTNMT、PsMSH、EcP6H和McDBOX2，扩展了从 (S)-SCO合成白屈菜红碱的途径。为了生成中间体别隐品碱，CjCAS（来自C. japonica）或CyCAS（来自C.yanhusuo），TfS9OMT*，PsTNMT和PsMSH被整合到(S)-SCO生产菌株中，获得菌株XJ0695。菌株XJ0741中的CjCAS比菌株XJ0742中的CyCAS表现出更高的活性。随后，引入McDBOX2，并分别与EcP6H、McP6H或CyP6H结合，所得菌株都产生了白屈菜红碱，其中EcP6H（菌株XJ0747）表现最佳。以上结果表明，McDBOX2表现出广泛的底物范围，导致白屈菜红碱、血根碱和白屈菜宾的生物合成。

优化DBOX表达，提高BZDAs产量

McDBOX2的表达导致OD₆₀₀降低且在产生白屈菜红碱的菌株XJ07411和产生血根碱的菌株XJ07437中 (S)-RET积累增加。同时，在 (S)-SCO产生菌株XJ0695中也发现 (S)-SCO产生减少和 (S)- RET积累增加。表明McDBOX2表达对BBE活性表现出限制作用。CyBBE_ERTS和McDBOX2在酵母中的表达有三个共同的特征，包括FAD依赖性氧化酶，产生副产物H₂O₂以及从内质网到高尔基体的运输途径。作者认为辅因子FAD的潜在竞争可能是影响BBE活性的主要因素。通过将质粒1）含有FAD ER定位转运体FLC1、FLC2、FLC3和YPR365C；2）线粒体FAD转运体 FLX1；3）质粒转运体MCH5；4）FAD生物合成相关基因FMN1和FAD1；5）枯草芽孢杆菌的BsRiba和BsRibc转化到菌株XJ0774中来提高FAD的可用性。与表达空质粒的对照菌株相比，表达MCH5或BsRibc的衍生菌株的白屈菜红碱产量分别增加了24%和39%，而 (S)-RET的积累量未发生显著变化。这表明MCH5或BsRibc的表达可能提高了McDBOX2的活性，而不是减轻对CyBBE_ERTS的限制。

作者分析认为可通过将McDBOX2进行区隔来规避对BBE活性的限制作用。首先尝试将McDBOX2靶向到内质网中。然而，(S)-RET滴度和最终OD₆₀₀与液泡型McDBOX2的菌株相当，表明McDBOX2靶向ER没有缓解这一问题。接下来，对McDBOX2的N端29个氨基酸进行截断。与不表达McDBOX2的菌株XJ07411相比，通过荧光标记证实细胞内表达的McDBOX2Δ29导致细胞生长不受抑制。此外，在菌株XJ07472（XJ07411+McDBOX2Δ29）中，所有的二氢白屈菜红碱都转化为白屈菜红碱。但40小时后，其产量略低于菌株XJ0747（XJ07411+McDBOX2），这可能是由于积累了更多的中间体 (S)-THC和 (S)-顺式-N-甲基氢化小檗碱，而不是降低了McDBOX2Δ29的活性。同样，与对照菌株XJ0750相比，菌株XJ07502（XJ07437+McDBOX2Δ29）恢复了生长，积累了较少的 (S)-RET，转化了所有的二氢血根碱，并产生了更多的血根碱。这表明McDBOX2Δ29在一定程度上缓解了BBE的限制。为了提高白屈菜红碱和血根碱的产量，在最终菌株XJ07474和XJ07504中，过表达MCH5、引入BsRibc和敲除OPI1的组合分别产生38.1 mg/L的白屈菜红碱和3.8 mg/L的血根碱。

图5  优化酵母中BZDAs的生物合成