山东农业大学：SRCAP 参与猪繁殖与呼吸综合征病毒激活的 Notch 信号通路

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猪繁殖与呼吸综合征（PRRS）是由猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）引起的一种疾病，对全球养猪产业造成了巨大的经济损失。该病毒不仅会导致怀孕母猪的繁殖失败，还会引起各年龄段猪只的呼吸窘迫。尽管已有一些研究对PRRSV的生物学特性和致病机制进行了探讨，但目前尚缺乏有效的疫苗和治疗药物。因此，深入理解PRRSV与宿主相互作用的分子机制，对于开发新的防治策略具有重要意义。

2024年11月12日，山东农业大学基础兽医学系在Journal of Virology上发表题为“SRCAP is involved in porcine reproductive and respiratory syndrome virus activated Notch signaling pathway”的最新研究论文，本研究揭示了PRRSV非结构蛋白4（Nsp4）的互作组，并鉴定出SRCAP作为其互作蛋白之一。

图1. Nsp4相互作用组GFP和GFP-Nsp4的表达分析

2.Nsp4 相互作用组的验证

通过生物重复实验验证了LC-MS/MS结果的可靠性，选择三个蛋白（SRCAP、MYH10和TRIM28）进行验证，这些蛋白在与Nsp4的相互作用中显示出不同的肽段数量、在pEGFP和pEGFP-Nsp4之间的比例差异以及生物学功能。通过重复的pull-down实验，以及使用特定蛋白抗体进行的Western blot验证，结果显示SRCAP、MYH10和TRIM28在pull-down实验中被检测到。此外，通过免疫沉淀（IP）实验进一步确认了这些蛋白与Nsp4的共沉淀，表明它们能够与pEGFP-Nsp4共定位。共定位的检测方法对于确定可能的相互作用至关重要。在pEGFP-Nsp4转染的293T细胞和PRRSV感染的MARC-145细胞中，通过共聚焦显微镜观察到Nsp4与SRCAP和TRIM28共定位，但与MYH10和EGFP没有共定位。这些结果共同证明了质谱结果的高可靠性，并为Nsp4的互作组提供了实验支持。

图2.GFP-Nsp4 相互作用组的验证

3.SRCAP 促进 PRRSV 复制

SRCAP与Nsp4的相互作用最为可能，因此在MARC-145、PK15CD163和PAM细胞中检测了SRCAP在PRRSV感染中的作用。结果显示，TA-12病毒感染可以上调SRCAP的表达，而敲低SRCAP则能减少TA-12的感染。此外，研究还发现，敲低SRCAP能够减少所有三种PRRSV（CH-1R、TA-01和TA-02）的感染。然而，热灭活的TA-12对SRCAP的表达没有影响。通过进一步的实验，研究者们确认了SRCAP在PRRSV生命周期中的作用，发现敲低SRCAP仅能减少PRRSV的复制，而不是吸附、内化或释放。这些结果强烈表明SRCAP在PRRSV复制过程中发挥了促进病毒复制的作用。

图3.SRCAP 促进了 PRRSV 感染

4.SRCAP 通过激活非经典 Notch 信号促进 PRRSV 感染

研究发现，TA-12病毒感染能够上调Notch信号相关基因HES1和HES5的表达，并下调RBP-Jκ。通过敲低SRCAP，可以阻断TA-12感染，降低HES1和HES5的表达，并上调RBP-Jκ，这与Notch信号通路抑制剂LY-411575的效果一致。此外，通过CRISPR/Cas9技术敲除SRCAP的MARC-145细胞（SRCAP-KO）显示，SRCAP的缺失可以减少PRRSV的复制，并抑制Notch信号的激活。进一步的实验表明，SRCAP敲除后，Notch信号通路的激活剂或抑制剂对HES1、HES5或RBP-Jκ的表达没有影响，证实了PRRSV激活的Notch信号通路依赖于SRCAP。这些结果表明，PRRSV感染通过激活非典型Notch信号通路来促进其复制，而SRCAP在这一过程中起着关键作用。

图4.PRRSV 激活非经典 Notch 信号通路

图5.确认 SRCAP 在 SRCAP 敲除的 MARC-145 细胞中的作用

5.SRCAP 通过与 Nsp4 相互作用激活非经典 Notch 信号

通过构建SRCAP的不同功能域并进行免疫沉淀实验，研究发现SRCAP的ATPase I-IV结构域与Nsp4相互作用。进一步的实验通过GFP pull-down和肽段pull-down实验揭示了Nsp4中的特定氨基酸序列122VITEA126对于与SRCAP的ATPase I-IV结构域的相互作用至关重要。通过突变分析，研究者们确定了Nsp4中与SRCAP相互作用的关键位点，并构建了基于TA-12的突变PRRSV（rTA-12/5A），其中Nsp4的122位点被突变为丙氨酸。结果显示，这种突变病毒的复制效率降低，且不能激活Notch信号通路，进一步证实了SRCAP与Nsp4相互作用在PRRSV激活非典型Notch信号通路中的必要性。这些发现为理解PRRSV如何通过宿主因子调控信号通路提供了新的视角，并可能为开发针对PRRSV的新型治疗策略提供潜在的靶点。

图6.识别SRCAP和Nsp4之间的相互作用区域

图7.Nsp4 与 SRCAP 的相互作用对于 SRCAP 的功能至关重要

6.阻断Notch信号通路抑制PRRSV体内外感染

研究者们探索了阻断Notch信号通路对PRRSV感染的影响。通过使用γ-分泌酶抑制剂LY-411575，研究者们发现这种药物能够显著降低PRRSV在体外培养的MARC-145细胞和PAM细胞中的复制，包括病毒基因组、蛋白表达和病毒滴度的减少。此外，LY-411575还影响了病毒的核内Notch片段（NICD）的水平，减少了其在细胞核中的分布。在体内实验中，通过向感染PRRSV的猪只注射LY-411575，研究者们观察到药物处理组的猪只体温下降、病毒血症和鼻腔拭子中的病毒载量降低，肺部的病理变化也得到了缓解。这些结果表明，通过抑制Notch信号通路可以有效地抑制PRRSV的复制，为PRRSV感染的治疗提供了新的策略。

图8.Notch 信号通路抑制剂 LY-411575 可在体外抑制 PRRSV 感染

图9.LY-411575 抑制体内 PRRSV 感染

本研究揭示了SRCAP作为PRRSV非结构蛋白Nsp4的互作蛋白，通过激活非典型Notch信号通路促进病毒复制的新机制。研究发现，SRCAP与Nsp4的相互作用对于Notch信号通路的激活至关重要，这一发现为理解PRRSV的致病机制提供了新的视角。

此外，通过使用Notch信号通路抑制剂LY-411575，研究在体外和体内模型中均证实了阻断Notch信号通路可以抑制PRRSV的感染，这表明Notch信号通路可能是PRRSV感染的一个关键调控点，为开发新的抗病毒策略提供了潜在的靶点。

总之，这些发现不仅增进了我们对PRRSV与宿主相互作用的理解，也为未来PRRSV疫苗和治疗药物的开发提供了重要的分子基础，可能对控制和预防PRRS具有重要意义。

https://journals.asm.org/journal/jvi on 17 N

投稿合作：shouyiyanquan@163.com