RNA 介导的核酸/蛋白质组装及应用丨再创
学术
2024-11-04 15:25
福建
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在今年的 SEED 2024会议（Synthetic Biology: Engineering， Evolution & Design）上，来自莱斯大学的 Joff Silberg 教授介绍了一种具有自催化能力的 RNA 核酶（ribozyme）。这种核酶能够在序列匹配后进行自催化，使两端 RNA 的部分结构融合在一起，可以看作是具有自催化能力的内含肽的 RNA 版本。这样的结构有许多潜在应用，比如在微生物群体中插入 RNA 条形码以探究环境中细菌群落的分布，或通过两个 RNA 相互催化形成一个完整蛋白，实现特定细胞生产特定的功能蛋白。（推荐阅读：Gambill, L., Staubus, A., Mo, K.W. et al. A split ribozyme that links detection of a native RNA to orthogonal protein outputs. Nat Commun 14, 543 (2023).）在这篇 2024 年 8 月发表于 ACS Synthetic Biology 的文章「Ribozyme-mediated gene-fragment complementation for non-destructive reporting of DNA transfer within soil」中，Joff 团队将该结构应用于探讨土壤中基因的水平转移现象。通过核酶介导的基因片段互补来报告土壤中的水平基因转移现象的方法，该方法有效避免了无接合作用时的泄露表达，能更准确报告土壤中水平基因转移现象。再创为各位读者整理了这项应用。Malyn A. Selinidis,Andrew C. Corliss,James Chappell,Jonathan J. Silberg / 作者
水平基因转移现象（horizontal gene transfer，HGT）是指基因从一个生物体转移到另一个非后代生物体的过程，这种现象在自然界中广泛存在，尤其在细菌中非常普遍。在这个过程中微生物能获得一些新的性状，如耐热性、抗毒性，甚至抗生素耐药性等。土壤中的水平基因转移现象对合成生物学在土壤中的应用构成了威胁。目前监测这种现象的方法包括化学方法和合成生物学方法。化学方法主要原理是将移动 DNA 与宿主 DNA 交联，随后进行测序判断；合成生物学方法则主要通过设计基因回路，使细胞在摄取外界 DNA 时产生特定信号，如荧光、抗性等。
合成挥发性气体的酶也可用于报告土壤中的微生物行为。比如 mht 基因编码 MHT 酶（甲基卤化物转移酶）能够产生 CH3Br，进而我们可以收集土壤样本上方挥发性气体，进行气相色谱分析。此前在 HGT 现象的监测中也有类似应用，即将 mht 基因插入移动基因并连接到启动子后，编码产生挥发性气体。然而这种方法存在泄露问题，泄露累积会造成监测背景过高。最新的RNA 工程研究发现，核酶切割后的RNA片段本身没有活性，但存在 RNA 相互作用序列时，就能够介导结合。换而言之，RNA相互作用序列的存在使得本身没有活性的RNA片段能够与特定的分子或结构结合，进而实现一定的生物功能。蛋白质互补片段结合能够产生有功能的蛋白质（上图A），核酶互补片段结合亦能得到与原本功能相同的核酶（上图B）。在这个基础上，作者将蛋白质片段 1 和核酶片段 1 组合，将核酶片段 2 和蛋白质片段 2 结合，并成功验证这两个组合片段能够互补，并且在转录后，核酶片段自切并介导两端 MHT 蛋白 mRNA 互补片段结合，得到有功能的 MHT 蛋白 mRNA，翻译得到 MHT 蛋白并产生 CH3Br 气体（上图C.D）。在初步验证该设计的可行性后，作者探究了温度对该设计的影响，实验结果证明在实验探究的 3 种温度下该设计活性接近。由于要应用到土壤中，作者也探究了在土壤渗透压和营养条件下该设计的活性，在浓度较高的培养基 M63 中产气量较高。要将该设计应用到实际中，我们还需关注该设计能否报告接合基因转移。因此，作者用第一种质粒（mht1-ribo1）转化供体细胞，用第二种质粒（mht2-ribo2）转化受体细胞，观察该设计是否能报告接合基因转移。实验结果表明，没有发生接合作用时，没有检测到气体信号；发生接合作用时，能检测到气体信号。接下来，作者将该设计应用到实际土壤中。由于供体细胞是 DAP 缺陷型，需要额外添加 DAP，作者通过评估得知 DAP 在土壤中生物利用度较低，需要添加更高浓度 DAP。实验结果表明该设计在实际土壤中也能够发挥作用，并且是否发生接合作用的组别之间区别明显。最后，作者又研究了在供体细胞的质粒中直接添加 dap 基因后该设计是否还有效，实验结果表明，虽然比原本 CH3Br 气体观测水平低，但该设计仍然是有效的。该设计的优势与提升：
综上，作者的设计能够通过核酶介导的基因片段互补从而报告土壤中的水平基因转移现象，相比于通过在启动子后插入 GFP 基因等类似方法相比，该方法有效避免了无接合作用时的泄露表达，能更准确报告土壤中水平基因转移现象，即实现了基因转移报告的严格控制，这是本文最大的亮点，并且该过程也不需要氧气参与（GFP 需要氧气）。另外，该方法取土壤上方空间气体进行气相色谱分析，无需从微生物中提取基因，因此能兼容各种环境材料。简评：
实现无水平基因转移时严格控制气体表达，而在发生水平基因转移时产生气体作为报告信号，这是对先前应用的一个显著改进。过去的许多应用都受到泄露表达带来的背景噪声影响，而这种新方法能够有效减少这一问题。但是，该设计直接投入到土壤中使用，且表达有害气体 CH3Br，会对人体产生不良影响，有待后续优化。此外据了解，这种自催化 RNA 核酶可以携带的蛋白大小理论上可以达到 Cas9 的规模。他们主要通过 DNA 表达出核酶，然后进行信号感应。通过直接递送 RNA，是否也可以与现有的一些哺乳动物细胞疗法进行结合？这或许也会是该结构未来的应用之一。![]()
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