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内容来源于New Phytologist
酶是细胞和生物体生命活动的重要驱动力之一，在新陈代谢、信号传导和世代交替过程中发挥重要作用。酶的功能取决于其活性，因此直接监测酶活性非常重要（Gardner et al.，2021）。传统上采用RT-qPCR（Jozefczuk & Adjaye，2011）、融合荧光蛋白标记（Cui et al.，2016）和Western Blot分析（Hnasko & Hnasko，2015）等手段检测酶蛋白，但这些仅在RNA或蛋白质水平评估酶的含量以间接体现酶活性高低。然而酶活性的发生不仅依赖于酶的含量，并且其特定的结构、修饰及环境也会影响活性，因此这些传统手段均不能准确反映生物体内酶的真实活性情况。基于催化反应设计的荧光探针可特异性被目标酶催化（Liu et al., 2018)，并改变其原有的荧光性质（如荧光强度、发射波长、激发波长、发光效率等），通过检测探针被目标酶催化前后荧光性质的变化，可以对酶真实催化活性的进行准确的量化检测。目前，基于酶催化活性的荧光检测探针已在临床诊断、癌症成像和新药研发中做出了重大贡献，但在植物研究中尚未有报道。2024年9月，New Phytologist 在线发表了上海中医药大学中药研究所陈万生教授课题组联合交叉科学研究院王平研究员及上海师范大学生命科学学院薛景石副研究员题为An activity-based sensing fluorogenic probe for monitoring O-methyltransferase in plants 的研究论文，筛选并建立了基于酶催化活性反应的植物重要次生代谢产物修饰酶氧甲基转移酶（OMT）酶活性活体原位监测方法。植物氧甲基转移酶（OMTs）由I类咖啡酰辅酶A OMT（CCoAOMT）和II类咖啡酸OMT（COMT）亚群组成，是参与各种次生代谢产物O-甲基化修饰的一类重要酶（Ibrahim et al.，1998）。它们不仅可以使植物合成一系列具有经济和药用价值的化合物，而且在调控植物细胞功能方面发挥着重要作用。因此，建立一种简单有效的植物细胞OMTs活性监测方法将有助于深入了解植物OMT相关的生物过程。在该研究中，作者基于植物OMTs催化反应特性设计并合成了一系列探针，并从中筛选到能够被OMTs酶催化并转化为荧光产物的探针3-BTD（图1）。图1. 基于酶催化反应的植物OMTs酶活性检测探针的设计与表征进一步的通过使用重组酶对酶浓度、探针浓度、反应时间、温度、pH以及常见干扰物氨基酸及金属离子等进行一系列体外方法学考察后，利用模式植物拟南芥及相应突变体开展了体内方法学研究（图2）。模式植物拟南芥中，AtCOMT（At5g54160）和AtCCoAOMT（At4g34050）是其中关键的功能酶。使用3-BTD对植物OMTs进行酶活性检测发现在任一单个基因的功能缺失突变体中都能检测到信号，但在双突变体里，检测不到信号。表明该方法具有良好的特异性。同时值得注意的是，与传统融合荧光蛋白标记方法进行比较发现，基于融合荧光蛋白标记拟南芥AtCCoAOMT在核和胞质积累，但基于3-BTD探针只在胞质中检测到酶活反应，核定位的AtCCoAOMT并不具有酶活。这与近期复旦大学常芳教授课题组发现核定位AtCCoAOMT具有转录调控功能相契合。
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图2. 3-BTD用于模式植物拟南芥叶片OMTs酶催化活性检测综上，该研究工作首次针对植物重要次生代谢合成途径修饰酶氧甲基转移酶筛选建立了基于酶催化反应活性的酶活性活体原位检测方法。在此基础上，针对其它重要次生代谢合成途径酶酶活性检测探针的开发将有助于我们全面了解和认识重要次生代谢产物合成发生规律。
上海中医药大学中药研究所陈万生教授课题组肖莹研究员、陈万生教授，交叉科学研究院王平研究员及上海师范大学生命科学学院薛景石副研究员为论文共同通讯作者。上海中医药大学中药研究所博士后贾鑫磊博士，已毕业硕士研究生朱礼祥、李元玉为论文共同第一作者。新加坡国立大学生命科学系邵凯博士，陈万生教授课题组讲师冯婧娴、副研究员邱实，以及康缘医药研究院高级工程师杨颖博参与了该研究工作。该研究得到了国家重点研究计划、国家自然科学基金以及上海市优秀学术/技术带头人计划等项目资助。
https://doi.org/10.1111/nph.20104
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