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DOI：10.3877/cma.j.issn.2095-7157.2024.02.005
基金项目：内蒙古自治区卫生健康科技计划项目(202201438);包头市卫生健康科技计划项目（wsjkkj018）;内蒙古自治区高等学校科学研究项目（NJZY22057）;准格尔旗科技计划项目(2020YY-05);2018年“草原英才”工程创新创业团队(00118326)
作者单位：014030内蒙古，内蒙古科技大学包头医学院第二附属医院 内蒙古消化病研究所1； 014040内蒙古，内蒙古科技大学包头医学院研究生院2;010399内蒙古，准格尔旗中心医院3
通信作者：党彤，Email：dtong999@sina.com
【摘要】目的 利用探头式共聚焦激光显微内镜（pCLE）间接评价幽门螺杆菌（Hp）相关性萎缩性胃炎（HpCAG）除菌治疗后胃黏膜屏障功能变化情况，以探究Correa级联反应中黏膜屏障功能的可逆转性。方法 选取2023年1月1日至2023年12月31日包头医学院第二附属医院行无痛胃镜检查并且Hp呼气试验阳性患者42例，所有患者行胃镜与pCLE检查。根据病理诊断结果分为非萎缩性胃炎（NAG）组18例、萎缩性胃炎(AG)组13例和肠化生(IM)组11例。比较各组除菌治疗前后平均荧光强度、荧光素钠渗漏面积及荧光素钠渗漏量的变化情况。结果 NAG组纳入94个部位、AG组纳入64个部位、IM组纳入58个部位。除菌前NAG组、AG组荧光素钠渗漏面积、荧光素钠渗漏量均大于除菌后，差异有统计学意义（P<0.05）；除菌前NAG组平均荧光强度大于除菌后，差异有统计学意义（P<0.05）；IM组除菌前后荧光素钠渗漏参数无统计学差异（P>0.05）。结论 随着Correa级联反应的进展，胃黏膜屏障功能逐步受损，进展至IM时，胃黏膜屏障功能损伤短期内呈现不可逆趋势。
【关键词】幽门螺杆菌；探头式共聚焦激光显微内镜；逆转
胃癌是我国癌症的第三大死亡原因，我国每年胃癌预计新发病例35.87万例，死亡病例26.04万例［1］。幽门螺杆菌（helicobacter pylori，Hp）通过破坏细胞间紧密连接的结构与功能从而引起的Correa级联反应进展［2,3］，其中幽门螺杆菌相关性萎缩性胃炎（helicobacter pylori-associated chronic atrophic gastritis，HpCAG）是胃癌的重要前期病变，所以早期发现并根除Hp 可以预防病变进展，降低胃癌风险。
近年来，探头式共聚焦激光显微内镜（probe-based confocal laser endomicroscopy, pCLE）因其操作简单，并且能在无痛内镜过程中对黏膜进行实时显微评估而引起广泛关注［4］。pCLE发射激光光束扫描黏膜表面，组织内的荧光物质被激光照射后发出520~650 nm波长的光线［5］，聚焦到检测孔处形成点像，然后将其转化为数字信号，最终形成共聚焦图像［6］。
荧光素钠是目前在pCLE操作中最常用的荧光对比剂。静脉注射荧光素钠后，其主要停留在血管中，在胃黏膜屏障功能未受损时，荧光素钠极少从毛细血管渗漏至腺体间隙［7］。在胃黏膜屏障功能受损时，黏膜细胞间的紧密连接被破坏，黏膜通透性增加，导致荧光素钠渗漏至黏膜细胞间隙［8］，在pCLE下可见黏膜屏障损伤区域细胞间隙较周围更亮。此外，在细胞脱落的部位，可以看到荧光素钠进入由上皮细胞脱落后形成的间隙［7］。国内一项研究利用pCLE以半定量的方法对肠上皮化生（intestinal metaplasia，IM）荧光素钠渗漏量评分，以评估胃黏膜屏障破坏情况［4］。发现pCLE半定量图像分析结果与透射电子显微镜检查结果有良好的线性相关性（R2=0.834，P <0.0001）。
本研究利用ImageJ软件定量测量pCLE下荧光素钠渗漏程度以此来间接评价非萎缩性胃炎（non-atrophic gastritis，NAG）、萎缩性胃炎（atrophic gastritis，AG）和IM在根除Hp 后其黏膜屏障功能的变化情况。
资料与方法
一、一般资料
选取2023年1月1日至2023年12月31日经包头医学院第二附属医院拟行无痛胃镜检查的42例Hp 呼气试验阳性患者，排除1例因青霉素过敏患者，41例患者行无痛胃镜检查、pCLE检查与铋剂四联除菌治疗，共有5例患者因上消化道肿瘤（2例）或铋剂四联除菌方案失败（3例）被排除在外。最后入组36例患者，其中男15例（41.67%）、女21例（58.33%），年龄25~70岁，平均年龄（51.72±12.76）岁。共纳入216个部位，根据除菌前病理诊断结果，分为NAG组94个部位、AG组64个部位、IM组58个部位。所有pCLE影像资料由我院内镜中心参与胃镜检查的1名护士进行编号、pCLE检查、数据收集和结果分析并隐去患者基本信息。
二、纳入及排除标准
1．纳入标准：年龄18~75周岁，拟行无痛胃镜检查人群；并签署内镜知情同意书；同意入组该研究并签署入组知情同意书；既往未行Hp 根除治疗；行Hp 呼气试验且在呼气检测前4周未服用抗生素及质子泵抑制剂；完成胃部pCLE 检查，图像完整、清晰度可；具有完整的内镜下活检组织病理学结果。
2．排除标准：有严重的心脑血管疾病；有出血倾向性疾病；发现非典型增生、上消化道肿瘤或曾行胃切除术；对荧光素钠或青霉素过敏而不能进行pCLE检查或Hp 一线治疗者；铋剂四联除菌方案失败。
三、研究方法与检查过程
1．研究方法：本研究是一项探索性研究。研究遵循赫尔基宣言，获得我院伦理委员会批准（审批号：2022年科伦审第2X-082）。
2．器械：胃镜操作系统(主机:CV-290，内镜:GIF-HQ290, 日本Olympus公司)、pCLE系统(Gastroflex, 法国Mauna Kea Technologies公司)。
3.检查过程：确定入组患者，于检查前20 min行荧光素钠过敏试验：静脉推注2%荧光素钠注射液（美国Alcon Research LLC公司）1 ml进行过敏反应试验；于检查前10 min与水混服二甲硅油散（中国自贡鸿鹤制药有限公司）及链霉蛋白酶颗粒（中国泰德制药股份有限公司）清除胃内泡沫与黏液，盐酸利多卡因（中国济川药业集团有限公司）行咽部麻醉。麻醉医师静脉注射丙泊酚（中国西安力邦制药有限公司，1.5~2.5 mg/kg诱导麻醉，每小时4~12 mg/kg维持麻醉）行全身麻醉，并全程监测患者生命体征。由1名高年资内镜医师（胃镜检查10 000例以上，年检查1 000例以上）进行无痛胃镜检查，摄片完毕后，静脉注射10%荧光素钠注射液1 ml。通过胃镜活检通道送入pCLE探头，将pCLE探头与胃黏膜轻柔的垂直接触，避免损伤黏膜。每个部位观察时间不少于2 min，总体观察时间不少于8 min，记录并保存pCLE视频资料。分别在胃窦、胃角、胃体萎缩明显处行靶向活检，无明显萎缩处行阴性活检（胃窦大弯侧、胃角中部、胃体中部小弯侧），并对pCLE视频资料（.mp4格式）作离线保存。检查完毕后由内镜医师将患者送入复苏室，并向患者家属交代注意事项，嘱患者多饮水，以利于荧光素钠排出。
所有患者在完成内镜检查后，予以铋剂四联除菌方案14 d治疗，铋剂四联除菌方案为阿莫西林胶囊（1 000 mg、2次/d）、克拉霉素片（500 mg，2次/d）、枸橼酸铋钾胶囊（220 mg、2次/d）、艾司奥美拉唑肠溶片（20 mg，2次/d）［9］。停药1月，复查 Hp呼气试验。为评价HpCAG除菌后短期内变化，本研究设计在Hp呼气试验阴性1周后，即安排pCLE检查。pCLE复查时对活检位置周围区域进行重点扫查，将pCLE影像资料离线保存。
四、pCLE影像资料的定量分析
由1名具有3年以上pCLE读片经验的内镜医师对pCLE影像资料进行定量测量。本研究使用ImageJ软件测量pCLE下各组的平均荧光强度、荧光素钠渗漏面积及荧光素钠渗漏量，以评估黏膜屏障功能受损情况(图1)。ImageJ软件可以将pCLE图片转换为单色的荧光图片，对于单色图片每个点的灰度值代表了该点的荧光强度大小。
平均荧光强度间接反映了黏膜通透性大小，即某个区域黏膜通透性越大，则该区域荧光强度越大［10］。荧光素钠渗漏面积间接反映了被H.pylori 破坏的黏膜面积大小。荧光素钠渗漏量为两者的乘积，间接反映了荧光素钠渗漏的总量。
幽门腺与胃底腺黏膜屏障功能正常时，胃底腺与幽门腺分别可见圆形胃小凹与棒状胃小凹，无荧光素钠渗漏。NAG时，幽门腺与胃底腺分别表现为分枝状胃小凹与非连续性的棒状胃小凹，中央开口扩张，伴散在局灶性荧光素钠渗漏［11］。AG时，胃小凹数目减少，间隙增宽，中央开口扩张,腺体间隙间可见荧光素钠渗漏［12］。IM时，pCLE下可见腺体中大而黑的杯状细胞和细长的柱状吸收细胞，黏膜表面可见清晰的黑线,为刷状缘，腺体外可见荧光素钠渗漏［13］。
五、统计学分析
采用SPSS25.0统计学软件处理数据，符合正态分布的计量资料以均数±标准差（x±s）表示；非正态分布的计量资料用M（P25, P75）表示。计数资料用例数及百分比表示。非相关样本比较采用Mann-Whitney U秩和检验，相关样本比较采用Wilcoxon相关秩和检验。
结 果
一、荧光素钠渗漏面积的比较
NAG组、AG组与IM组除菌前、除菌后荧光素钠渗漏面积（图2）。AG组除菌前荧光素钠渗漏面积大于NAG组与IM组，差异具有统计学意义（P<0.05）;NAG组与IM组除菌前荧光素钠渗漏面积差异无统计学意义（P=0.687）。NAG组除菌后荧光素钠渗漏面积小于AG组与IM组，差异具有统计学意义（P<0.01）;AG组与IM组除菌后荧光素钠渗漏面积差异无统计学意义（P=1.00）。
NAG组、AG组除菌前荧光素钠渗漏面积均大于除菌后，差异具有统计学意义（P<0.01）；IM组除菌前荧光素钠渗漏面积与除菌后差异无统计学意义（P=0.247）。
二、平均荧光强度的比较
NAG组、AG组与IM组除菌前、除菌后平均荧光强度（图3）,三组间荧光素钠平均强度差异无统计学意义（P=0.87）。
NAG组除菌后平均荧光强度小于AG组与IM组，差异具有统计学意义（P<0.01）;AG组与IM组除菌后平均荧光强度差异无统计学意义（P=1.00）。
NAG组除菌前平均荧光强度大于除菌后，差异具有统计学意义（PP<0.01）；AG组、IM组除菌前平均荧光强度与除菌后差异无统计学意义（P>0.05）。
三、荧光素钠渗漏量的比较
NAG组、AG组与IM组除菌前、除菌后荧光素钠渗漏量（图4）。AG组除菌前荧光素钠渗漏量大于NAG组与IM组，差异具有统计学意义（P<0.01）；NAG组与IM组除菌前荧光素钠渗漏量差异无统计学意义（P=0.554）。
NAG组除菌后荧光素钠渗漏量小于AG组与IM组，差异具有统计学意义（P<0.01）；AG组与IM组除菌后荧光素钠渗漏量差异无统计学意义（P=1.000）。
NAG组、AG组除菌前荧光素钠渗漏量均大于除菌后，差异具有统计学意义（P<0.01）；IM组除菌前荧光素钠渗漏量与除菌后差异无统计学意义（P=0.127）。
讨 论
Hp 是Correa级联反应的重要始动因素，HpCAG作为癌前病变是胃癌发生发展过程中的重要环节。Ohata等［14］发现HpCAG患者的胃癌发病率与Hp 阳性NAG患者和Hp 阴性CAG患者相比分别高4.9倍与14.5倍。所以内镜下准确诊断HpCAG尤为重要。
白光内镜对于HpCAG的诊断效能较低，因为单纯的胃黏膜炎症与HpCAG在白光内镜下均可表现为黏膜水肿伴有发红糜烂［15］，导致内镜操作医师对于两种病变的诊断不清。之后出现的细胞内镜与电子染色内镜在诊断效能上有所提升，Liu等［12］研究发现细胞内镜诊断HpCAG灵敏度为83.85%，特异度为81.42%；电子染色内镜诊断HpCAG的灵敏度为83.08%，特异度为76.42%，但诊断效能仍有提升空间。
pCLE作为一种新型内镜，可以观察黏膜组织的微观结构，无疑是诊断HpCAG的一把利器。在过去的几年中，一些研究观察了胃炎和癌前病变中胃黏膜屏障功能的变化情况［4,16］。Rui等［4］利用pCLE评价IM除菌前后黏膜屏障功能的变化情况，发现IM所导致的黏膜屏障功能障碍可能是长期改变，但其仅对胃黏膜的荧光渗漏进行分级评价，而未定量比较。Wang等［16］利用Adobe Photoshop软件量化胃黏膜黄色变化程度，来反映黏膜渗出的荧光素钠量，进而评估黏膜屏障损伤程度。
在本研究中除菌治疗前AG组荧光素钠渗漏量、荧光素钠渗漏面积与平均荧光素钠强度均显著高于NAG组，这表明Hp 的存在会持续损伤胃黏膜屏障功能。同样，Yu等［17］通过测量pCLE下CAG与NAG的腺体间隙，发现CAG腺体间隙明显大于NAG，表明在Correa级联反应进展过程中，胃黏膜上皮屏障功能在逐步损伤。而IM组的荧光素钠渗漏量与渗漏面积小于AG组，这可能是机体为对抗Hp 的损伤，代偿性化生的杯状细胞、吸收细胞与潘氏细胞［18］，使pCLE镜头下的荧光素钠渗漏相对减少。然而， Wang 等［16］的研究发现IM与AG荧光素钠渗漏无统计学差异，这可能是由于该研究以半定量分级标准定义荧光素钠渗漏，IM与HpCAG之间的微弱差异可能分到同一等级，而本研究为定量分析荧光素钠渗漏参数。
目前对Hp 根除后HpCAG的逆转，仍有争议［19］。本研究中随着Correa级联反应的进展，荧光素钠渗漏变化量逐渐减小，直至IM组，除菌前后荧光素钠渗漏参数无统计学差异。当Correa级联反应进展至IM时，胃黏膜屏障功能就达到了其短期内自身修复能力的极限。Wang等［16］研究也证实了这点，其以半定量的方式定义pCLE下胃癌前病变黏膜屏障功能的损伤情况，发现一旦超过IM的不可逆点，根除Hp 对阻碍病变进展的作用就微乎其微了。一项荟萃分析发现HpCAG在根除Hp 1年至3年后才出现逆转［19］。这可能是由于大部分研究为白光内镜下诊断后进行病理活检［20,21］，而白光内镜诊断HpCAG效力不足［17］，进而影响了活检病理的准确性。
本研究为单中心，小样本研究存在一定局限性。在AG组与IM组中未能对比不同严重程度除菌前后黏膜屏障功能的变化情况。
综上所述，随着Hp 对胃黏膜屏障功能的损伤加重，胃黏膜屏障修复功能也在逐步下降，直至呈现出不可逆趋势。所以在Hp 感染后越早行根除治疗，胃黏膜屏障功能逆转的可能性越大。
作为新兴内镜，pCLE在过去几年内发展迅速，在临床应用中的地位也不断提高。pCLE技术可实现对Correa级联反应监测，为病变进展提供可视化评估，有望成为Correa级联反应进展监测的重要手段，对于胃癌的早期诊断和干预具有重要的临床意义。
参考文献(略)
李志伟,汤泊夫,孙鹤,等.利用探头式共聚焦激光显微内镜荧光定量评价除菌治疗对幽门螺杆菌相关性萎缩性胃炎黏膜屏障功能影响的研究［J/CD］.中华胃肠内镜电子杂志，2024，11（2）: 94-99.
