【Nature Genetics】CosMx空间单细胞分析揭示治疗所诱导的胰腺癌微环境重塑事件和机制

近期，来自麻省总医院、Broad研究所的一个研究小组基于CosMx单细胞空间转录组学技术，开发出一套空间约束优化传输互作分析（SCOTIA）计算模型，将单细胞空间转录组图谱与临床前数据相结合，不仅描绘了原发性胰腺导管腺癌（PDAC）的肿瘤微环境（TME）特征，还深入探究了PDAC在新辅助化疗和放疗中的多细胞空间邻域和细胞间相互作用的重塑情况，并发现了与治疗反应相吻合的关键分子通路变化。基于这些发现，研究人员认为TME中细胞间相互作用变化可为解决耐药性提供新见解。该研究小组也提出该研究所采用的空间分析可以广泛应用于其他疾病研究。

该研究成果于9月3日发表在《Nature Genetics》杂志上。

胰腺导管腺癌（PDAC）是一种预后极差的恶性肿瘤，5年总体生存率约为13%。治疗失败或效果不佳的主要原因包括细胞内的转录重编程以及与肿瘤微环境（TME）中的细胞-细胞间相互作用。因此，透彻理解TME中的细胞间相互作用将对新治疗靶点的发现，改善临床治疗方法带来巨大帮助。

单细胞测序技术可以从组织裂解的单个细胞中获取基因表达信息，分析推测出细胞间相互作用。然而，由于单细胞RNA测序数据丢失了空间信息，忽略了组织原位细胞间的空间接近性，限制了对细胞-细胞相互作用的深入分析。

最新的CosMx单细胞空间原位分子成像技术可以实现真正的单细胞分辨率，甚至亚细胞分辨率，并可以同时对大量（6000+）的RNA靶标进行空间定位和表达定量，进而支持对细胞间相互作用的原位检测分析和可视化展示，为了解治疗前后TME中的细胞间相互作用提供了前所未有的机会。

该项目采用的核心研究方法：

• CosMx空间单细胞转录组学分析：研究人员利用CosMx技术在空间原位对每个单细胞获得了超多RNA靶标的表达信息，剖析了人类胰腺癌组织中与新辅助化疗和放疗相关的多细胞邻域和细胞间相互作用的重塑。

• 空间约束最优传输相互作用分析（SCOTIA）：为了充分挖掘CosMx所提供的丰富数据，研究团队开发了一种转化生物学空间分析方法，该方法将单细胞空间转录组学与前沿的计算方法和临床前模型相结合，整合了配体和受体的基因表达信息以及它们之间的空间距离，进而识别与新辅助化疗和放疗相关的肿瘤微环境中细胞间相互作用的变化。

研究人员基于CosMx空间单细胞转录组数据和SCOTIA分析方法揭示了治疗引起的配体-受体相互作用的显著变化和肿瘤微环境重塑。具体而言，研究人员发现，在治疗后癌症相关成纤维细胞（CAFs）与恶性细胞之间的配体-受体（LR）相互作用发生了显著变化，且治疗后的样本中IL-6家族信号通路明显富集，这种信号转导在功能上赋予了化疗抗性。

研究人员利用CosMx技术从13个PDAC患者FFPE样本中获得了70多万个细胞的转录组数据，绘制了高质量的胰腺癌单细胞空间图谱。

• 研究样本：人类原发性PDAC 肿瘤样本，其中包括6例接受新辅助化疗的病例和7例未接受治疗的病例。

• 检测方案：CosMx™ Universal Cell Characterization RNA Panel (960 RNA) + 30个额外定制探针。

研究人员基于相邻切片的H&E染色结果指导CosMx对组织切片上的FOV选择，结合病理学家的经验，最终选取了309个FOV。为了确保分析的可靠性，研究人员使用了两种不同的方法进行了细胞分割，结果发现两者结果高度一致。

为了描述PDAC的空间组织特征，研究人员首先使用监督聚类（以单细胞核RNA测序（snRNA-seq）数据为参考），对CosMx获得的细胞进行了注释和细胞亚群的识别。其中对CAFs和恶性细胞的进一步亚群分类后，研究人员确定了五个细胞亚群：炎性CAFs（iCAF）、肌成纤维CAFs（myCAF）、经典（CLS）恶性细胞、基底样（BSL）恶性细胞以及神经样祖细胞（NRP）恶性细胞亚型。NRP细胞只占所有恶性细胞的4%，表现出干细胞样和神经发育特征。尽管NRP细胞所占比例相对较小，但与双亚型（CLS、BSL）模型相比，纳入NRP亚型为该研究分析提供了重要见解。

对经过治疗和未经治疗的肿瘤样本细胞类型进行比较分析发现，虽然中性粒细胞只占细胞总数的 0.53%，但在未经治疗的样本中却发现了91.4%的中性粒细胞。与此一致，研究人员观察到恶性细胞和CAFs中与中性粒细胞趋化相关的趋化因子在经过治疗的样本中表达量明显降低，这表明治疗样本中中性粒细胞的丰度较低可能部分归因于招募的减少。经治疗的患者和未经治疗的患者的外周血中的中性粒细胞计数无明显差异，这进一步支持了治疗样本中中性粒细胞密度较低是由于中性粒细胞招募进入TME减少而非全身中性粒细胞耗竭的解释。

研究人员分析了恶性腺体的亚型组成。在该研究中，恶性腺体的亚型定义为至少由五个恶性细胞组成的空间细胞集群。首先由经过认证的病理学家确定不同集群。接下来结合CosMx成像信息和特定算法（DBSCAN），最终发现在大多数FOV中，经由算法生成的腺体亚型结果与病理学家手动注释结果一致。

然后，研究人员比较了各腺体中恶性细胞的数量和恶性亚型的比例。与未经治疗的样本相比，经过治疗的样本腺体由较少的细胞组成。事实上，经过治疗的样本中单个恶性细胞的比例明显高于未经治疗的的样本，这表明恶性细胞在治疗后不易聚集成腺体结构，65%的腺体主要（>70%）由单一恶性亚型组成，而其他腺体则由多种亚型混合组成，CLS为主的腺体明显大于BSL为主的腺体和NRP为主的腺体。

接下来，研究人员建立了一个测量不同细胞类型接近度的分析模型，并应用该模型探究了CAF亚型与恶性细胞之间的空间关联。该分析表明，相较于iCAFs，myCAFs与恶性细胞的距离更近，但按恶性亚型分层后发现，NRP恶性细胞表现出相反的模式，即相较于myCAFs，NRP与iCAFs表现出更多的共定位。此外，研究人员还发现不同恶性肿瘤亚型与CD8 T细胞之间存在空间关联。

为了了解配体-受体相互作用在不同细胞类型和治疗条件下的差异，研究人员基于CosMx空间单细胞转录数据开发了一种计算方法（SCOTIA），能够将配体和受体的表达水平与空间距离进行整合分析，进而追踪与治疗反应相关的细胞间相互作用变化和多细胞肿瘤微环境特征。在将治疗后的残留肿瘤样本与未经治疗的肿瘤进行比较时，研究人员发现CAFs和恶性细胞之间的相互作用强度差异最大。

具体而言，研究人员发现，在尚未接受治疗的PDAC患者TME中，CAF和恶性细胞之间的配体-受体相互作用更为明显，发现了有60对配体-受体活动加剧，而化疗后检测到的配体-受体只有大约20对。这些结果表明，CAF在调节恶性细胞和TME中发挥重要作用，且和治疗相关。

为了进一步明确新辅助治疗是否与CAF和恶性细胞之间相互作用的显著差异有关，研究人员确定了在接受治疗的肿瘤中显著富集的24对LR和在未接受治疗的肿瘤中显著富集的60对LR。在这84对富集的LR中，有64对配体和受体在所属的CAF和恶性细胞中都表现出高表达。

治疗后富集的LR主要与趋化作用、细胞因子信号转导、基质和细胞外基质（ECM）重塑以及免疫调节有关。有趣的是，其中一些配体（包括TGFB1和CXCL12）和受体（包括CXCR3、CXCR4和ACKR3）与治疗耐药性有关。研究人员还发现，白细胞介素IL-6家族信号传导和JAK/STAT激活也与治疗相关，这与许多恶性肿瘤的上皮细胞向间质转化（EMT）、侵袭、转移、免疫调节以及对化疗和放疗的耐药性有关。化疗耐药性与IL-6家族信号异常高表达之间的联系影响了肿瘤细胞与CAF之间的相互作用。

对治疗后“清除”的LR对进行系统分析后发现，最具代表性的LR变化对应了恶性细胞在CAFs的胶原蛋白、血管生成因子和造血生长因子刺激下的整合素介导的反应。另一组被治疗“清除”的LR相互作用由WNT信号转导因子组成。

研究人员还发现，与未经治疗的恶性细胞和经过治疗的CAFs相比，治疗后的恶性细胞WNT配体表达水平明显更高。此外，与未经治疗的CAFs相比，经过治疗的CAFs的WNT配体的表达量较低。一些干扰素信号对和细胞因子相互作用也在治疗后表达降低。这些结果表明，在未经治疗的肿瘤中，CAF与恶性细胞的相互作用表现出高水平的旁分泌Wnt信号、ECM-整合素串联、干扰素信号和特定的细胞因子信号，而这些信号在化疗和放疗后可能会被破坏。

研究人员随后在体外小鼠模型和人类细胞系实验中验证了这些与治疗相关的TME变化。综上所述，研究人员证明了SCOTIA算法能够整合单细胞空间信息和基因表达信息，从而识别出在治疗过程中发生改变的LR候选基因。

接下来，研究人员试图确定SCOTIA所鉴定出的与治疗相关的LR对是否会在小鼠模型（小鼠恶性细胞-CAF协同培养肿瘤系统）中重现。利用snRNA-Seq对小鼠模型进行分析发现，与SCOTIA分析的CosMx数据一致，在经治疗的小鼠模型中上调的LR富含趋化性和细胞迁移相关特征，而在未经治疗的小鼠模型中高表达的LR显示出与ECM和PI3K通路相关。

总之，这些研究结果表明，研究人员结合CosMx空间单细胞转录组数据和SCOTIA分析方法鉴定出的与治疗相关的LR对在不同物种和实验背景下都是稳健的。

在人类样本和小鼠模型中所发现的治疗富集的CAF-恶性肿瘤细胞相互作用中，研究人员均观测到IL-6家族成员，包括CLCF1-CNTFR和LIF-IL6ST。

早期研究发现，产生IL-6的iCAFs与EMT密切相关。该研究中的SCOTIA分析结果显示，治疗后CAFs和癌细胞之间的IL-6家族信号转导富集。这些发现表明，iCAFs可能通过IL-6家族LR信号通路与癌细胞相互作用，该方式在细胞毒性治疗中得到加强。

研究意义：这项研究展示了如何通过CosMx单细胞空间转录组学对肿瘤微环境进行表征，从而识别可能在治疗耐药性出现中起作用的分子相互作用。这对于开发新的治疗策略和药物靶点具有重要意义。

结论：该研究整合了实验和计算方法，以高分辨率、空间为导向，提供了一种新的视角来理解胰腺癌治疗前后肿瘤微环境的动态变化，特别是CAFs与恶性细胞之间的相互作用，确定并验证了IL-6信号在CAFs和癌细胞之间的传递是一种化疗耐药机制，增加了对胰腺癌治疗响应的深入理解，并为未来的治疗策略提供了潜在靶点和新的研究方向。

研究人员的分析突显了多细胞与特定恶性细胞状态的空间关联，以及治疗和未治疗环境中癌症相关成纤维细胞（CAFs）与恶性细胞之间配体-受体相互作用的显著差异，包括治疗肿瘤中白细胞介素-6（IL-6）信号的富集。

该研究所发现的与治疗相关的TME变化也得到了体内外肿瘤类细胞共培养系统的正交数据集的支持。

讨论：该研究小组表示将开展进一步研究，剖析其他候选细胞-细胞相互作用在促进疾病进展和耐药性方面的具体功能和机制，并最终指导治疗方法的开发。这项工作提供了一种广泛的转化方法，利用单细胞空间转录组学来更好地理解基底细胞和癌细胞之间的相互作用。