年度优秀论文 | 犬尿氨酸代谢通路对牙周膜干细胞成骨分化的影响

健康 2024-10-12 16:47 北京

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作者：王南南钱俊张杨珩崔迪刘蓉廖文正李艳芬闫福华

通信作者：闫福华

作者单位：南京大学医学院附属口腔医院·南京市口腔医院牙周病科

引用本文：王南南, 钱俊, 张杨珩, 等. 犬尿氨酸代谢通路对牙周膜干细胞成骨分化的影响[J]. 中华口腔医学杂志, 2023, 58(7): 650-658. DOI: 10.3760/cma.j.cn112144-20230318-00095.

摘要

目的

探索犬尿氨酸代谢通路对牙周膜干细胞（periodontal ligament stem cells，PDLSC）成骨分化的影响，为研究牙周炎微环境对牙周组织再生的影响提供依据。

方法

于2022年6至10月在南京大学医学院附属口腔医院牙周病科、口腔综合科收集19例牙周炎患者（牙周炎组）和19例牙周健康者（牙周健康组）的非刺激性唾液，采用超高效液相色谱-串联质谱检测两组受试者唾液中犬尿氨酸及其代谢产物的含量。对牙周炎组和牙周健康组的牙龈组织通过免疫组化检测吲哚胺2，3-双加氧酶（indoleamine 2，3-dioxygenase，IDO）与芳香烃受体（aryl hydrocarbon receptor，AhR）的表达情况。收集因正畸治疗需要拔除的前磨牙5颗（来自2022年7至11月南京大学医学院附属口腔医院口腔颌面外科12~18岁的5例就诊患者），从离体牙上提取PDLSC，使用成骨诱导分化培养基（对照组）或含有20 μmol/L犬尿氨酸的成骨诱导分化培养基（犬尿氨酸组）培养7 d，对成骨诱导的PDLSC进行碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）染色和ALP活性测定。通过实时荧光定量PCR（real-time fluorescence quantitative PCR，RT-qPCR）检测对照组和犬尿氨酸组PDLSC成骨相关基因ALP、骨钙素、runt相关转录因子2（runt-related transcription factor 2，RUNX2）、Ⅰ型胶原蛋白（collagen type-Ⅰ，COL-Ⅰ）mRNA表达和犬尿氨酸通路相关基因AhR、细胞色素P450家族成员（cytochrome P450 family，CYP）1A1、1B1 mRNA的表达。通过蛋白质印迹法检测对照组和犬尿氨酸组RUNX2、骨桥蛋白（osteopontin，OPN）和AhR蛋白表达情况。培养21 d时，用茜素红染色评估对照组和犬尿氨酸组PDLSC矿化情况。

结果

牙周炎组唾液中犬尿氨酸［8.26（0，19.60）nmol/L］及犬尿喹啉酸［11.4（3.34，13.52）nmol/L］含量均显著高于牙周健康组［分别为0.75（0，4.25）、1.92（1.34，3.88）nmol/L］（Z=-2.84，P=0.004；Z=-3.61，P<0.001）。牙周炎组牙龈组织中IDO（18.33±2.22）和AhR的表达（44.14±13.63）均显著高于牙周健康组（分别为12.21±2.87、15.39±5.14）（t=3.38，P=0.015；t=3.42，P=0.027）。ALP活性测定显示，与对照组（329.30±19.29）相比，犬尿氨酸组PDLSC ALP活性（291.90±2.35）显著下降（t=3.34，P=0.029）。RT-qPCR结果显示，犬尿氨酸组PDLSC ALP、骨钙素和RUNX2表达（0.43±0.12、0.78±0.09、0.66±0.10）均较对照组（1.02±0.22、1.00±0.11、1.00±0.01）显著下降（t=4.71，P=0.003；t=3.23，P=0.018；t=6.73，P<0.001），AhR、CYP1A1 mRNA表达（1.43±0.07、1.65±0.10）均较对照组（1.01±0.12、1.01±0.14）显著升高（t=5.23，P=0.006；t=6.59，P<0.001），两组间col-ⅰ、cyp1b1 p>0.05）。蛋白质印迹法结果显示，犬尿氨酸组OPN、RUNX2表达（0.82±0.05、0.87±0.03）与对照组（1.00±0.00、1.00±0.00）相比均显著下降（t=6.79，P=0.003；t=7.95，P=0.001），AhR表达（1.24±0.14）显著高于对照组（1.00±0.00）（t=3.04，P=0.039）。

结论

牙周炎患者犬尿氨酸通路异常激活，不仅能上调AhR相关通路，还能抑制PDLSC的成骨向分化。

牙周炎是由菌斑微生物引起的牙周支持组织慢性炎症反应性疾病，其主要病理特征为牙槽骨吸收和牙周袋形成。目前，牙周基础治疗和手术治疗对控制牙周炎进展有一定效果，然而已经破坏的牙周组织仍难以实现再生。因此，探索牙周炎患者牙槽骨破坏的机制非常重要。

干细胞能自我更新并分化为多种细胞类型，具有巨大的治疗潜力。牙周膜干细胞（periodontal ligament stem cells，PDLSC）是来源于牙周膜的间充质干细胞，在适宜条件下能分化为成骨细胞，促进骨修复，在牙周组织再生方面发挥重要作用^［^1 , 2 ］。与其他类型间充质干细胞相比，PDLSC处在特殊的微环境中。口腔中存在大量细菌，口腔黏膜的天然屏障可有效阻断细菌的局部侵入。发生牙周炎时口腔黏膜屏障受损，致病菌侵入增加，宿主免疫应答紊乱，局部微环境的改变能降低PDLSC的成骨分化能力，而受损的PDLSC又会进一步加重牙周骨破坏^［^3 , 4 ］。

色氨酸是人体必需的芳香族氨基酸，参与体内多种生理功能。临床研究表明，唾液中色氨酸含量与菌斑指数、牙周探诊出血位点百分比呈正相关关系^［^5 ］。本课题组近期研究发现，牙周炎患者唾液中色氨酸含量显著高于牙周健康者，但其在牙周炎中的作用仍有待探索^［^6 ］。色氨酸在机体内主要通过3种途径被代谢为活性分子：犬尿氨酸途径、5-羟色胺途径和吲哚途径，其中超过95%的色氨酸通过犬尿氨酸途径被代谢。生成的犬尿氨酸通过不同途径被进一步代谢为犬尿喹啉酸、邻氨基苯甲酸、氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸^［^7 ］。以往研究表明，血清犬尿氨酸水平随着年龄增加而升高，且其能通过靶向骨髓间充质干细胞和破骨细胞引起系统骨代谢紊乱^［^8 , 9 ］。因此，推测牙周炎患者唾液微环境中犬尿氨酸浓度的变化可能对牙周组织再生有一定影响。

本研究检测牙周健康者和牙周炎患者唾液及牙龈组织中犬尿氨酸相关代谢产物及蛋白，并通过体外细胞实验研究犬尿氨酸代谢通路对PDLSC成骨分化能力的影响，以期为进一步探讨牙周炎微环境对牙周组织再生的影响提供理论依据。

材料和方法

临床样本收集及相关实验方案已通过南京大学医学院附属口腔医院伦理委员会的审批［批准号：2019NL-008（KS）］，所有患者均已签署知情同意书。

1.主要试剂与仪器：α-最低基础培养基（alpha minimal essential medium，α-MEM）、青霉素-链霉素双抗、胰蛋白酶（Gibco，美国）；胎牛血清、无菌磷酸盐缓冲液（phosphate buffer solution，PBS）（Corning，美国）；地塞米松、β-甘油磷酸钠、L-犬尿氨酸、L-抗坏血酸、Triton X-100裂解液（Sigma-Aldrich，美国）；细胞计数（cell counting kit-8，CCK-8）检测试剂（Dojindo，日本）；碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）检测试剂盒、5-溴-4氯-3-吲哚基-磷酸盐（5-Bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate，BCIP）/氯化硝基四氮唑蓝（nitrotetrazolium blue chloride，NBT）ALP显色试剂盒、苯甲基磺酰氟（phenylmethanesulfonyl fluoride，PMSF）、放射免疫沉淀法（radioimmunoprecipitation assay，RIPA）裂解缓冲液（上海碧云天生物技术研究所）；牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）（BioFroxx，德国）；Tris缓冲液（tris buffered saline with Tween，TBST）［生工生物工程（上海）股份有限公司］；超敏化学发光试剂盒（苏州新赛美生物科技有限公司）；茜素红染色液（广州赛业生物科技有限公司）；通用型RNA提取试剂盒、反转录试剂预混液（湖南艾科瑞生物工程有限公司）；实时荧光定量PCR（real-time fluorescence quantitative PCR，RT-qPCR）试剂（南京诺唯赞生物科技股份有限公司）；芳香烃受体（aryl hydrocarbon receptor，AhR）抗体、骨桥蛋白（osteopontin，OPN）抗体、runt相关转录因子2（runt-related transcription factor 2，RUNX2）抗体、β-肌动蛋白（β-actin）抗体（Proteintech，武汉三鹰生物技术有限公司）；吲哚胺2，3-双加氧酶（indoleamine 2，3-dioxygenase，IDO）抗体（Abcam，英国）；辣根过氧化物酶（horseradishperoxidase，HRP）标记山羊抗兔IgG（武汉赛维尔生物科技有限公司）；山羊抗小鼠IgG、山羊抗兔IgG（Bioworld，南京巴傲得生物科技有限公司）；倒置显微镜（Nikon，日本）；超高效液相色谱仪（Sciex，美国）；液相色谱柱（Waters，美国）；质谱仪（Sciex，美国）；半干转印槽、ABI ViiA7 RT-qPCR仪（Thermo Fisher Scientific，美国）；数字化切片扫描仪（3DHISTECH，匈牙利）；凝胶电泳仪（Bio-rad，美国）。

2.研究对象的选择：

（1）纳入标准：牙周健康者，①年龄18~50岁；②口内卫生状况良好；③无牙周疾病史。牙周炎患者，①年龄18~50岁；②口内留存牙≥20颗；③探诊深度≥6 mm；④邻面最重位点的临床附着丧失≥5 mm；⑤影像学牙槽骨吸收至根中1/3及以上；⑥全口牙中伴有附着丧失及骨吸收位点数≥30%。

（2）排除标准：①患全身性疾病，如高血压、糖尿病、血液病、类风湿关节炎等免疫性疾病；②近1年内接受过牙周治疗；③近6个月内使用过抗生素、非甾体类抗炎药或其他影响炎症反应的药物；④妊娠期或哺乳期女性；⑤伴有其他严重口腔疾病；⑥使用烟草制品。

3.样本收集：

（1）唾液样本：根据纳入和排除标准，选取2022年6至10月于南京大学医学院附属口腔医院牙周病科、口腔综合科就诊的患者38例，其中牙周健康者19例（牙周健康组）、牙周炎患者19例（牙周炎组）。嘱受试者前一晚刷牙后禁食水，并于次日上午到医院进行唾液样本采集。采集期间嘱患者勿吮吸，每隔1~2 min将唾液吐入50 ml离心管中，采集量约2 ml，即刻置于-80 ℃冰箱内保存。

（2）牙周膜组织：选择于2022年7至11月在南京大学医学院附属口腔医院口腔颌面外科门诊就诊的12~18岁患者5例，经患者知情同意，收集因正畸治疗需要拔除的前磨牙5颗，用于后续PDLSC的分离培养。

（3）牙龈组织：牙周炎组牙龈组织来自因治疗需要拔除且伴有牙周炎的牙齿周围牙龈；牙周健康组牙龈来自第三磨牙拔除术中切除的牙龈组织。使用生理盐水对牙龈样本进行冲洗，去除血污后于4%多聚甲醛中固定。

4.实验方法：

（1）犬尿氨酸及其代谢产物检测：取100 μl唾液样本，加入400 μl甲醇/乙腈（1∶1，含0.1%甲酸及同位素标记内标混合物）提取液，混匀，冰水浴下超声5 min，-40 ℃下静置1 h后离心（12 000 r/min，15 min），取上清液，氮气吹干后以甲酸水溶液50 μl复溶，再次离心（12 000 r/min，15 min）后取上清液进行超高效液相色谱-串联质谱分析。

（2）人牙龈组织免疫组化染色：两组牙龈组织固定2 d后行石蜡包埋并制备成4 μm厚的切片，经过脱蜡、梯度脱水后，使用乙二胺四乙酸抗原修复，分别滴加IDO（1∶2 000）、AhR（1∶400）一抗4 ℃孵育过夜后，滴加HRP标记山羊抗兔IgG二抗孵育30 min，使用二氨基联苯胺进行染色、苏木精复染，经梯度脱水后封片。使用组织化学评分对染色结果进行评价。

（3）PDLSC的分离培养：将收集的牙周膜组织使用含3 mg/ml的Ⅰ型胶原酶和4 mg/ml的中性蛋白酶培养基消化1 h，然后将其置于含20%胎牛血清的α-MEM进行培养。每隔3天换液，待细胞生长至80%时传代，使用第3~5代PDLSC用于后续实验。

（4）CCK-8法检测细胞活力：PDLSC经过消化、离心后重悬，用细胞计数板计数，按5×10³个/孔的细胞密度将细胞接种至96孔板中，加入完全培养基（含10%胎牛血清和1%双抗的α-MEM）100 μl进行培养，待细胞贴壁后换液。犬尿氨酸组PDLSC使用含有20、40、60、80、100 μmol/L犬尿氨酸的完全培养基继续培养，同时设置空白对照组（不含PDLSC和犬尿氨酸）和对照组（不含犬尿氨酸）。于细胞培养的1、3、5、7 d，每孔避光加入含有10%CCK-8试剂的培养基，用酶标仪检测各孔在450 nm处的吸光度值（A值）。细胞活力（%）=［（犬尿氨酸组-空白对照组）÷（对照组-空白对照组）］×100%，每组重复3次。

（5）PDLSC成骨分化诱导：向完全培养基中加入矿化液（100 nmol/L 地塞米松、10 mmol/L β-甘油磷酸钠、50 mg/mL L-抗坏血酸）配成成骨诱导分化培养基。取第3代PDLSC，按1×10⁵个/孔的细胞密度将其接种至6孔板中，用完全培养基培养24 h后，对照组使用成骨诱导分化培养基培养，犬尿氨酸组使用含有终浓度为20 μmol/L犬尿氨酸的成骨诱导分化培养基继续培养，每隔3天换液。

（6）ALP活性测定：对照组和犬尿氨酸组PDLSC成骨诱导培养7 d后，弃上层培养基，加入1% Triton X-100裂解液后收集液体，离心（1 000 r/min，10 min）后取上清液。根据ALP检测试剂盒使用说明，加入检测缓冲液、显色底物、样本和工作液，37 ℃孵育5 min，加入终止液，于405 nm处测定A值。根据标准品浓度及对应的A值绘制标准曲线，计算样品中对硝基苯酚的浓度，并根据酶活性定义，计算样品二乙醇胺的酶活力单位。

（7）ALP染色：对照组和犬尿氨酸组PDLSC成骨诱导培养7 d后弃上层培养基，使用PBS洗3次，每孔加入4%多聚甲醛固定30 min，吸出固定液，并使用PBS反复冲洗，每孔加入2 ml BCIP/NBT染色工作液，避光静置10 min，去除染色液，使用去离子水冲洗后显微镜下采集图像。

（8）茜素红染色：对照组和犬尿氨酸组PDLSC成骨诱导培养21 d后弃上层培养基，使用PBS洗3次后，每孔加入4%多聚甲醛固定30 min，吸出固定液，并使用PBS反复冲洗，每孔加入2%茜素红染液染色15 min，去除染色液，使用去离子水冲洗后显微镜下采集图像。

（9）RT-qPCR：对照组和犬尿氨酸组PDLSC成骨诱导培养7 d后弃上层培养基，根据RNA提取试剂盒使用说明提取细胞总RNA，使用反转录试剂将1 μg RNA反转录为cDNA。以甘油醛-3-磷酸脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）为内参，采用RT-qPCR试剂行扩增反应，采用2^-ΔΔCt法计算相关基因mRNA相对表达量，各基因的引物序列见表1 。

（10）蛋白质印迹法检测：对照组和犬尿氨酸组PDLSC成骨诱导培养10 d，使用含1 mmol/L PMSF的RIPA缓冲液从PDLSC中提取总蛋白质。将蛋白样品加入4%~12%预制胶中，每孔20 μg，120 V恒压电泳60 min。25 V半干转印槽中转膜7 min。室温下使用5%BSA封闭60 min，4 ℃一抗孵育14 h，TBST洗膜3次，转入相应二抗常温孵育60 min，TBST洗膜3次，发光液避光孵育后曝光显影。以β-actin作为总蛋白内参，使用ImageJ 1.53软件（National Institutes of Health，美国）进行定量分析。

5.统计学分析：使用SPSS 26.0软件对数据进行统计学分析，通过Shapiro-Wilk检验验证数据是否符合正态分布，将符合正态分布的数据以“”形式表示，两组间比较使用独立样本t检验，多组间比较采用单因素方差分析，两两多重比较选用Dunnett t检验。对不符合正态分布的数据以“M（Q₁，Q₃）”形式表示，两组间比较使用Mann-Whitney U检验。以双侧P<0.05为差异有统计学意义。

结果

1.两组受试者唾液中犬尿氨酸及其代谢产物的浓度比较：见图1 。牙周炎组唾液中犬尿氨酸［8.26（0，19.60）nmol/L］及其代谢产物犬尿喹啉酸［11.4（3.34，13.52）nmol/L］浓度均显著高于牙周健康组［分别为0.75（0，4.25）和1.92（1.34，3.88）nmol/L］（Z=-2.84，P=0.004；Z=-3.61，P<0.001）。犬尿氨酸的另一代谢产物邻氨基苯甲酸在牙周炎组［2.01（1.62，6.69）nmol/L］与牙周健康组唾液中浓度［2.63（1.39，4.60）nmol/L］差异无统计学意义（Z=-0.22，P=0.827）。

图1 两组受试者唾液中犬尿氨酸及其代谢产物的浓度比较 A：犬尿氨酸；B：犬尿喹啉酸；C：邻氨基苯甲酸

2.两组受试者牙周组织中IDO及AhR蛋白表达的比较：见图2 。免疫组化结果显示，牙周炎组牙龈组织中IDO（18.33±2.22）和AhR蛋白表达（44.14±13.63）均显著高于牙周健康组（分别为12.21±2.87、15.39±5.14）（t=3.38，P=0.015；t=3.42，P=0.027），且牙周炎组IDO和AhR蛋白主要表达于上皮层。

图2 犬尿氨酸通路在牙周健康组和牙周炎组牙龈组织中的表达 A、B为免疫组化染色，棕色为吲哚胺2，3-双加氧酶（IDO）阳性，箭头示阳性区域，A：牙周健康组；B：牙周炎组；C、D为免疫组化染色，棕色为芳香烃受体（AhR）阳性，箭头示阳性区域，C：牙周健康组；D：牙周炎组
3.犬尿氨酸对PDLSC细胞活力的影响：见表2。与对照组［（100.00±0.67）%］相比，20、40、60、80、100 μmol/L犬尿氨酸与PDLSC共培养7 d后，细胞活力［分别为（99.30±1.00）%、（99.45±1.26）%、（100.60±0.66）%、（99.70±1.74）%、（99.64±0.74）%］均未受到显著影响（P>0.05）。

4.犬尿氨酸对PDLSC成骨分化能力的影响：ALP和茜素红染色显示，犬尿氨酸能明显抑制PDLSC成骨分化和钙化结节的形成（图3 ， 4 ）。进一步定量分析发现，犬尿氨酸组ALP活性（291.90±2.35）与对照组（329.30±19.29）相比显著下降（t=3.34，P=0.029）。RT-qPCR结果显示，犬尿氨酸组ALP、骨钙素、RUNX2 mRNA表达水平（分别为0.43±0.12、0.78±0.09、0.66±0.10）均显著低于对照组（分别为1.02±0.22、1.00±0.11、1.00±0.01）（t=4.71，P=0.003；t=3.23，P=0.018；t=6.73，P<0.001），犬尿氨酸组COL-Ⅰ mRNA表达（0.74±0.11）与对照组（1.02±0.21）相比差异无统计学意义（t=2.31，P=0.061）。蛋白质印迹法结果显示，犬尿氨酸组成骨相关蛋白OPN（0.82±0.05）、RUNX2（0.87±0.03）表达与对照组（分别为1.00±0.00、1.00±0.00）相比均显著下降（t=6.79，P=0.003；t=7.95，P=0.001）（图5 ）。

图3 对照组和犬尿氨酸组人牙周膜干细胞成骨诱导7 d碱性磷酸酶（ALP）染色结果 A、B为肉眼观，A：对照组；B：犬尿氨酸组；C、D为镜下观，C：对照组；D：犬尿氨酸组

图4 对照组和犬尿氨酸组人牙周膜干细胞成骨诱导21 d茜素红染色结果 A、B为肉眼观，A：对照组；B：犬尿氨酸组；C、D为镜下观，C：对照组；D：犬尿氨酸组

图5 犬尿氨酸对人牙周膜干细胞芳香烃受体（AhR）和成骨相关蛋白表达水平影响的蛋白质印迹法检测结果

5.AhR及其下游靶基因的表达比较：犬尿氨酸组中AhR及其下游靶基因细胞色素P450家族成员（cytochrome P450 family，CYP）1A1 mRNA表达量（分别为1.43±0.07、1.65±0.10）均显著高于对照组（分别为1.01±0.12、1.01±0.14）（t=5.23，P=0.006；t=6.59，P<0.001），犬尿氨酸组CYP1B1 mRNA表达量（1.64±0.47）与对照组（1.00±0.06）相比差异无统计学意义（t=2.31，P=0.082）。蛋白质印迹法结果同样显示，犬尿氨酸组AhR表达（1.24±0.14）与对照组（1.00±0.00）相比显著上升（t=3.04，P=0.039）（图5 ）。

讨论

PDLSC是来源于牙周膜的间充质干细胞，在牙周组织再生、维持牙周稳态方面发挥重要作用。近年研究发现，牙周微环境与PDLSC存在交互作用，牙周炎导致的微环境改变能降低PDLSC的成骨能力，而功能受损的PDLSC可通过加重宿主免疫反应，促进血管异常增生和破骨细胞活性，进而影响牙周微环境^［^{3 ， 10 ］}。本研究对牙周炎患者唾液中代谢物进行检测，并通过细胞实验进一步探索牙周炎微环境改变对PDLSC成骨分化的影响。

在牙周炎的发生过程中，牙周组织的上皮屏障、先天性免疫细胞、龈沟液和唾液中的IgA、IgG、IgM抗体等构成了对抗外源性菌斑侵袭和破坏牙周组织的第一道防线^［^11 ］。一旦这种平衡被打破，牙周微环境可发生改变，导致局部组织处于氧化应激状态，炎症微环境增加，促进牙周疾病的发生^［^12 ］。大量研究已证实，炎症微环境能抑制PDLSC成骨分化能力^［^{13 , 14 ］}。除炎症状态的变化外，近年研究发现，与牙周健康者相比，牙周炎患者唾液代谢组学也发生显著变化。Liebsch等^［^15 ］对284例非糖尿病人群唾液进行代谢组学分析发现，苯丙氨酸、酪氨酸及其代谢产物在伴有牙周炎人群中显著升高。Balci等^［^5 ］分析了Ⅲ期牙周炎患者与牙周健康者唾液中游离氨基酸水平，结果显示牙周炎患者色氨酸含量与探诊出血、菌斑指数呈正相关。本课题组前期研究发现，牙周炎患者唾液中色氨酸含量显著高于牙周健康者^［^6 ］，本研究也发现色氨酸的主要代谢产物犬尿氨酸在牙周炎患者唾液中含量显著高于牙周健康者，进一步提示色氨酸相关通路异常可能与牙周炎的发展相关。

犬尿氨酸通路是色氨酸分解代谢的主要途径，其关键限速酶包括IDO和色氨酸2，3-双加氧酶（tryptophan 2，3-dioxygenase，TDO），激活后的IDO和TDO能将色氨酸降解为犬尿氨酸^［^16 ］。TDO主要位于哺乳动物肝脏中，而IDO在间充质干细胞、巨噬细胞等多种细胞中均有表达，在调节局部色氨酸分解中起重要作用。在炎症状态下IDO被激活，通过分解色氨酸抑制免疫机体应答。本研究结果显示，牙周炎患者唾液中犬尿氨酸及其代谢产物含量均显著升高，与以往研究结果一致^［^17 ］。体外研究证实牙周膜细胞在细菌脂多糖刺激下，能显著促进IDO的表达，促进色氨酸代谢生成犬尿氨酸^［^18 ］。然而另一项研究表明，牙龈卟啉单胞菌能显著抑制RAW264.7细胞中IDO活性及其下游信号通路，从而促进炎症反应^［^19 ］。这些研究结果的差异可能与刺激物种类、浓度、牙周炎模型不同等有关。此外，犬尿氨酸也可能与干细胞及免疫细胞的自噬、凋亡等有关^［^{9 ， 20 ］}。在未来的研究中，本课题组将收集更多的样本分析牙周炎微环境下犬尿氨酸及IDO的表达差异，并对犬尿氨酸调控牙周炎发展的具体机制进一步探索。

AhR是目前唯一已知的犬尿氨酸受体，其广泛表达于上皮细胞、免疫细胞、内皮细胞和基质细胞等多种细胞。犬尿氨酸通过与AhR结合并激活CYP1A1等下游细胞因子进而发挥其生物学效应。大量研究表明，AhR的改变可以直接影响成骨细胞和破骨细胞，改变骨代谢平衡。Izawa等^［^21 ］发现，在破骨细胞形成早期，破骨相关基因NF-κB受体激活蛋白配体能上调AhR的表达，促进破骨细胞生成。在AhR基因敲除（AhR^-/-）以及特异性敲除破骨细胞AhR基因小鼠中发现，小鼠长骨骨吸收减少，骨量增加，且特异性敲除破骨细胞AhR基因小鼠能缓解雌激素缺乏引起的长骨骨质吸收^［^22 ］。Kondrikov等^［^9 ］研究提示，犬尿氨酸能通过AhR信号通路诱导骨髓间充质干细胞衰老并抑制细胞自噬，使干细胞分化功能受阻进而导致骨代谢紊乱。Eisa等^［^23 ］研究发现，犬尿氨酸能驱动破骨细胞转录因子c-fos和NFATc1表达上调，导致破骨细胞数量增加，使用AhR拮抗剂后可以抑制该过程。本研究结果显示，犬尿氨酸能抑制PDLSC成骨分化，同时犬尿氨酸组PDLSC AhR及其下游靶基因CYP1A1的表达显著增加，提示犬尿氨酸可能通过AhR/CYP1A1通路影响PDLSC成骨向分化。

近年研究也发现，犬尿氨酸通路在骨质疏松和其他衰老相关疾病中起到重要作用。大量研究已证实血清中犬尿氨酸浓度随着年龄增长而升高，且与骨密度成反比，提示犬尿氨酸可能在骨重建过程中起重要作用^［^{8 ， 24 , 25 , 26 , 27 ］}。El Refaey等^［^28 ］研究发现，色氨酸能刺激骨髓间充质干细胞的增殖和分化，而犬尿氨酸能抑制这一作用。本研究使用不同浓度犬尿氨酸与PDLSC共培养，结果显示犬尿氨酸对PDLSC增殖无显著抑制作用，提示犬尿氨酸在PDLSC和骨髓间充质干细胞中作用可能不同。根据细胞活力实验及犬尿氨酸相关细胞研究报道^［^{9 ， 23 ， 29 ］}，本课题组使用终浓度为20 μmol/L犬尿氨酸进行后续成骨相关实验。ALP是成骨分化成熟的早期标志，RUNX2转录发生于成骨分化初始阶段，同时能诱导其他成骨相关基因的表达^［^30 ］。本研究发现犬尿氨酸能显著降低PDLSC的ALP、RUNX2的表达，ALP活性定量检测和茜素红染色结果进一步证实，犬尿氨酸抑制了PDLSC的成骨分化和矿化能力。然而牙槽骨组织的破坏及重建是一个动态过程，这一过程包括成骨细胞、破骨细胞、PDLSC和骨髓间充质干细胞等多种细胞^［^2 ］。本研究只观察了犬尿氨酸对PDLSC的影响，犬尿氨酸对破骨细胞以及炎症状态下其余干细胞的影响仍有待进一步探索。

综上所述，本研究表明牙周炎患者唾液中犬尿氨酸通路异常活化。体外研究显示，在对PDLSC增殖无明显抑制作用的条件下，犬尿氨酸能上调AhR信号通路，抑制PDLSC的成骨向分化。然而其具体机制，如是否与细胞自噬、凋亡等有关，以及如何通过调控犬尿氨酸代谢通路促进牙周组织再生还需要进一步研究。这些机制的阐释将为进一步探索牙周炎微环境对牙周组织再生的影响提供新的思路。

（参考文献略）

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