I 论文导读 |
近年来，猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）在全球范围内对养猪业造成了巨大的经济损失。PRRSV-1作为该病毒的一个主要基因型，在中国的发病率逐渐上升，但相关的研究却相对缺乏。
IF：4.0 中科院1区 | JCR/Q2 病毒 参考译文：华南地区新型PRRSV-1的分离鉴定、全基因组分析和致病性研究 第一作者： Huirui Xu, Yongsheng Xie 通讯作者：贺东生 |
I 主要研究结果 |
研究从中国南方一个疑似感染PRRSV的猪场收集了25头猪的肺、血清、淋巴结和脾脏样本。通过RT-qPCR分析，发现其中10头猪呈PRRSV阳性，阳性率为40%。GD2022毒株在PAMs和Marc-145细胞中进行了十代盲传，并通过RT-PCR对第十代的病毒上清液进行检测。研究结果显示，GD2022毒株能够在PAMs和Marc-145细胞中复制，并表现出CPE（细胞病变效应），而在阴性对照组中则没有复制。此外，病毒在MA104、3D4/21、ST、PK15和Vero细胞中无法复制。PCR检测结果与细胞病变结果一致，表明GD2022毒株仅能适应PAMs和Marc-145细胞。PCR扩增产物的序列分析显示，感染PAM细胞和Marc-145细胞的病毒序列100%相同，表明该毒株能在这些细胞上稳定传播。与NCBI数据库比对，GD2022毒株与PRRSV-1的同源性为77.4%至87.0%，确认为PRRSV-1毒株，并命名为GD2022。间接免疫荧光测定（IFA）结果显示，在GD2022感染的PAMs和Marc-145细胞中检测到PRRSV N蛋白，表明病毒已成功从临床样本中分离出来。透射电子显微镜下观察，病毒样本呈现为直径约80纳米的圆形病毒颗粒。
图1.猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）分离株的鉴定
图2.病毒粒子电子显微镜观察
2.病毒生长曲线和全基因组测序分析
通过测量对应时间点的病毒滴度TCID50来绘制病毒生长曲线。结果显示，在MOI = 0.02的条件下，病毒的TCID50在感染后72小时达到峰值，随后开始下降。同样，在MOI = 0.002的条件下，病毒的TCID50在感染后96小时达到峰值，然后开始下降。实验条件下，病毒在感染后48至72小时内增殖最快，病毒接种量增加时，达到TCID50峰值的时间更短。
此外，GD2022毒株的完整基因组序列长15058个核苷酸，包含8个开放阅读框（ORF1a、ORF1b、ORF2、ORF3、ORF4、ORF5、ORF6和ORF7），其长度分别为7154bp、4424bp、749bp、794bp、548bp、605bp、521bp和386bp。GD2022的基因组结构与已发布的PRRSV-1序列长度相似，表明该毒株具有典型的PRRSV-1基因组特征。
3.同质性分析和系统发育分析
同源性分析显示，GD2022毒株与PRRSV-1毒株的相似性最高，范围在77.4%至87.0%之间，与PRRSV-1代表性菌株（LV株）的相似性为87.0%，而与PRRSV-2代表性菌株（VR2332株）的相似性仅为59.7%。全基因组系统发育树的结果表明，GD2022位于PRRSV-1的一个小分支上，与PRRSV-1疫苗病毒在遗传上相距较远。基于ORF5基因的遗传演化分析表明，GD2022属于PRRSV-1的1型亚型，并且在遗传系统发育树上处于一个独立的分支。这些发现表明GD2022是一个具有独特遗传特征的新型PRRSV-1毒株，与已知的PRRSV-1毒株有明显区别，且与PRRSV-2毒株差异更大。
图3.GB 2022的全基因组分析
4.小猪的临床体征
接种GD2022毒株的小猪在第六天开始体温上升，到第八天时有一只小猪体温超过40°C。从第六天起，实验组小猪的体温比对照组高出1°C。整个实验过程中，对照组的小猪保持正常。在第三天，实验组小猪开始出现食欲减退。从第七天起，临床症状加重，实验组小猪开始表现出打喷嚏和喘息等呼吸道症状，并伴有呼吸困难。相比之下，对照组没有出现异常的临床症状。实验组小猪体重增长缓慢，且实验组小猪的体重显著低于对照组（P < 0.001）。这些结果表明，GD2022毒株感染后能引起小猪体温升高、食欲减退和呼吸道症状，对小猪的生长性能有负面影响。
5.病毒血症和抗体
在GD2022毒株感染的小猪中，病毒血症在感染后3至15天内被检测到。在3至15天的感染期内，感染小猪血清中的病毒RNA拷贝数超过了103拷贝/ml（图4C）。在感染后的第15天，血液中的病毒量达到了高峰。在整个实验期间，对照组的血清样本中未检测到病毒血症。通过ELISA评估了PRRSV抗体的血清水平。结果显示，在挑战后抗体水平呈现上升趋势。从第9天起，抗体水平高于试剂盒设定的阳性阈值，并保持持续上升的趋势。在对照组中，结果为阴性。
图4.体温变化
6.解剖后的病理观察
攻毒组的小猪出现明显的肺炎，肺部表面出现组织实变和出血点。心脏松弛并在心肌中出现出血点。脾脏边缘呈锯齿状，有明显出血点。扁桃体和淋巴结的目视观察没有明显的病变。对照组器官组织结构正常。
小猪肺组织结构异常，肺间质加厚，肺泡腔明显减少，渗出物增加，细胞数量减少。心脏纤维杂乱无章。脾脏、颌骨下淋巴结、扁桃体未见明显异常
图5.攻毒后小猪各组织器官病理变化结果
7.解剖后器官中病毒载量的评估
使用RT-qPCR定量心脏、肝脏、脾脏、肺、肾脏、扁桃体和淋巴结中的病毒载量。在肺部和扁桃体中观察到的病毒载量最高，肾脏的病毒含量最少。MHC染色结果显示肺部和颌骨下淋巴结有明确的阳性信号。对照组RTqPCR结果为阴性，MHC染色无阳性信号。以上结果分析中，GD 2022主要感染肺组织。
图6.器官组织中的病毒载量和组织病理切片免疫细胞化学结果
| I 研究总结 |
本研究成功地从中国南方一个猪场的临床样本中分离并鉴定了一种新型的猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）毒株GD2022。通过细胞培养、RT-qPCR、间接免疫荧光测定（IFA）和透射电子显微镜等技术，确认了该毒株的存在，并揭示了其能够稳定地在PAMs和Marc-145细胞中复制的特性。全基因组序列分析显示，GD2022毒株与已知的PRRSV-1毒株有较高的同源性，但形成了一个独立的遗传分支，表明它是一个具有独特遗传特征的新毒株。
在对GD2022毒株进行的致病性研究中，实验组小猪表现出了体温升高、食欲减退、体重增长缓慢和呼吸症状等临床症状，同时在感染后的3至15天内可检测到病毒血症，血清中PRRSV抗体水平也随时间上升。这些结果证实了GD2022毒株具有明显的致病性，能够引起小猪的临床疾病。对照组小猪则在整个实验期间保持正常，没有出现病毒血症或血清学反应，进一步验证了实验结果的可靠性。
doi: 10.3389/fmicb.2024.1465449
校对：Collin
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