ME丨江南大学刘龙教授团队通过重组酿酒酵母脂滴中的后角鲨烯模块以过量生产7-脱氢胆固醇

类固醇化合物是一类四环三萜衍生物，对膜的通透性和流动性以及膜结合蛋白的活性至关重要。它们广泛用于食品和制药行业。然而，过量游离甾醇衍生物的积累可能对细胞有毒，因为它会改变线粒体呼吸，产生有毒的甲基甾醇中间体。细胞通过在疏水细胞器中分离甾醇酯（SEs）和中间体来避免毒性。然而，这种隔离可以成为天然的物理屏障，在空间上将前体与途径酶分离，从而阻碍甾醇衍生的高价值产物的高效合成。

作者以菌株XG20（7-DHC滴度为455.6 mg/L）为出发菌株，分别过表达ERG2，ERG3和DHCR24，获得菌株XD1-XD3。过表达ERG2和DHCR24均明显提高了7-DHC的滴度，表明ERG2和DHCR24的过表达有利于促进7-DHC的合成。随后，作者将ERG2和DHCR24共表达，并增加DHCR24的拷贝数。当DHCR24的拷贝数增至3时，获得菌株XD6，其7-DHC滴度最高，达531.2 mg/L。进一步增加DHCR24的拷贝数未提高7-DHC滴度，作者推测7-DHC合成的限速步骤仍然存在。

接下来，作者分析了关键前体化合物-乙酰辅酶A和角鲨烯对7-DHC合成的影响。通过检测发现菌株XD6的乙酰辅酶A含量显著高于野生型菌株，表明乙酰辅酶A不是限制7-DHC合成的主要因素。然而，角鲨烯的积累并没有随着7-DHC滴度的增加而减少，表明前体角鲨烯的大量积累是影响7-DHC滴度增加的主要因素。为了揭示角鲨烯富集的原因，作者采用差示离心法分析了菌株XD6中角鲨烯的分布，结果表明，47%的角鲨烯主要集中在LDs中，浓度为352.3 mg/L。过氧化物酶体中角鲨烯滴度为157.4 mg/L，占总量的21%。内质网中角鲨烯含量为20.9 mg/L，占总含量的2.7%。细胞质中未检测到角鲨烯。角鲨烯主要被隔离在LDs中，表明隔离角鲨烯的缺乏是7-DHC合成的关键限速步骤。

为了探究角鲨烯的LDs隔离是否限制了7-DHC的高效合成，作者将角鲨烯后模块中参与角鲨烯转化到7-DHC的11种酶进行了细胞器定位分析。通过激光扫描共聚焦显微镜观察到的结果确定，ERG2、ERG3、ERG11、ERG24、ERG25、ERG26、ERG28和DHCR24定位在内质网（ER），ERG7定位在LDs，ERG1和ERG27具有ER和LDs双细胞器定位功能。角鲨烯后模块中的大多数酶都定位于内质网，表明酶和角鲨烯在空间上的隔离是限制角鲨烯转化为7-DHC的主要因素。

为了解决角鲨烯积累的问题，作者在LDs中重构角鲨烯后模块以增加对角鲨烯的利用。作者选用来自玉米的LD油质蛋白以提高靶向效率，根据激光共聚焦结果显示，油质蛋白可以同时将两种蛋白质靶向LDs。随后，作者将具有LDs靶向的DHCR24和ERG3基因引入菌株XD6，获得菌株XD8。该菌株7-DHC产量为603.7 mg/L，较菌株XD6提高了13.6%；角鲨烯滴度为430.6 mg/L，降低42.5%。羊毛甾醇在ERG11和C-4去甲基复合酶ERG25–ERG26–ERG27的催化下转化为酵母甾醇，ERG28作为支架固定C-4去甲基酶复合物ERG25–ERG26–ERG27。因此，只需要将ERG28与油质蛋白基因融合，即可将ERG25-ERG26-ERG27靶向LDs。基于此，作者将具有LDs靶向的ERG2和ERG28引入菌株XD8，获得菌株XD9，该菌株产生617.2 mg/L的7-DHC和322.3 mg/L的角鲨烯。随后，作者将ERG11和ERG24与油质蛋白基因融合后导入菌株XD9，获得菌株XD10。该菌株7-DHC滴度增加至684.1 mg/L，而角鲨烯滴度明显降低至23.1 mg/L。角鲨烯后模块相关酶的LDs靶向有效促进了角鲨烯转化为7-DHC。

菌株XD10的生物量明显下降，作者认为可归因于胞内游离的7-DHC过量积累抑制了酵母的生长。因此，研究了7-DHC在细胞内的分布情况，结果显示57%的7-DHC集中在LDs中，其浓度为303.1 mg/L。其次，为过氧化物酶体，7-DHC含量达106.6 mg/L，占总量的20.1%。细胞质和细胞膜中的7-DHC滴度为56.3 mg/L。在酵母中，多余的游离7-DHC被被甾醇酰基转移酶（ARE1和ARE2）酯化，以SEs的形式储存于LDs以避免毒性。作者在菌株XD10中分别过表达ARE1和ARE2，获得菌株XD11和XD12。ARE1的过表达未增加7-DHC的产量，而ARE2的过表达（菌株XD12）使7-DHC产量增加10.8%，达762.5 mg/L。TGL3、TGL4和TGL5是酿酒酵母中主要的三酰基甘油脂肪酶，它们催化了LDs内储存三酰基甘油的降解。因此，作者在菌株XD12中分别敲除了TGL3，TGL4和TGL5，获得菌株XD13-XD15。菌株XD13拥有最强的7-DHC合成能力（792.9 mg/L）。此外，与菌株XD12相比，菌株XD13的LDs数量增加。敲除TGL3导致细胞内游离7-DHC水平显著降低，减轻了对细胞生长的负面影响。菌株XD13的生物量与菌株XD10一致。表明降低胞内游离7-DHC的毒性和增加7-DHC的储存容量有利于7-DHC的合成。

外源基因的引入和代谢途径的改变往往导致宿主微生物氧化还原失衡。酵母中7-DHC的合成需要辅因子NAD(P)⁺的参与。在7-DHC合成过程中，HMG1和细胞色素P450都依赖于NADPH。同时，由于麦角甾醇合成受到抑制，产生过量的NADH。因此，通过过表达编码葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（ZWF1）、线粒体NADH激酶（POS5）和6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶（GND1）的关键基因，对NADPH进行再生工程。通过引入外源基因编码来自肺炎链球菌的成水NADH氧化酶（NOX）和来自荚膜组织浆的替代氧化酶（AOX1），对NADH进行再生工程。将NADPH再生酶基因（ZWF1、GND1、POS5）引入到菌株XD13中，分别得到菌株XD16、XD17和XD18。与菌株XD13和亲本酵母相比，引入3种NADPH再生酶基因后，胞内游离NADPH/NADP⁺比值升高。但7-DHC产量均未增加。菌株XD13较亲本菌株的NADH/NAD+比值升高，表明7-DHC合成途径的引入使细胞内NADH/NAD+比例升高而导致氧化还原失衡。将NADH再生酶基因（NOX、AOX1）引入到菌株XD13中，分别得到菌株XD19和XD20，其胞内游离NADH/NAD+比值分别降低了60.1%和75.5%。同时，菌株XD20的7-DHC产量增加了9.4%，达867 mg/L。以上结果表明，改善细胞内过量的NADH有利于7-DHC的合成。在3 L发酵罐中分批补料发酵工程菌株XD20，96 h时7-DHC滴度达到5.1 g/L。

为了评估发酵过程中产生的副产物，对菌株XD6和XD20的发酵结果进行了GC-MS分析。菌株XD6的发酵结果显示，7-DHC占29.78%，角鲨烯占20.04%，胆甾醇占9.73%，胆-7-烯-3-醇和胆-5,7-二烯-3-醇分别占5.73%和8.89%，其他副产物和杂质占25.83%。菌株XD20的发酵结果显示，7-DHC的比例增加到37.27%，胆甾醇增加到21.29%，胆-7-烯-3-醇和胆-5,7-二烯-3-醇的比例分别增加到2.01%和16.16%，其他副产物占23.27%，而角鲨烯含量可忽略不计。