摘要
原发性硬化性胆管炎（PSC）是一种以胆道炎症和纤维化为特征的慢性胆汁淤积性肝病，目前药物治疗效果不明显。我们在PSC患者和硬化性胆管炎小鼠模型中观察到干扰素(IFN)-γ反应增加。IFNγ改变了肝脏CD8+ T淋巴细胞和NK细胞的表型，增加了细胞毒性，IFNγ的缺失减少了肝细胞死亡，降低了肝脏炎症性巨噬细胞的频率，减轻了肝纤维化。因此，IFNγ依赖性免疫反应可能为硬化性胆管炎的未来治疗干预策略提供检查点。
引言
原发性硬化性胆管炎（PSC）是一种病因不明的慢性进行性胆道疾病，其特征是胆道炎症和纤维化、胆汁淤积、终末期肝病和恶性肿瘤的高风险。大约60%的PSC患者为男性，70%至80%患有炎症性肠病。PSC的发病率和患病率都在增加，这表明目前的医疗效果较差。PSC被认为是一种免疫介导的胆道疾病。遗传数据提供了对免疫基因座的深入了解，这些基因座属于易引起自身免疫性危险因素常见位点，最引人注目的是人类白细胞抗原（HLA）与PSC的关联，类似于典型的自身免疫性疾病。这表明T细胞依赖性、适应性免疫应答参与PSC的免疫发病机制。事实上，在PSC患者中已经观察到活化的CD4+ T细胞凋亡失调和调节性T细胞功能障碍。
此外，PSC患者的研究显示T淋巴细胞浸润增加，并倾向于Th1细胞的浸润，定位于胆管和门静脉束周围。此外，在PSC患者中检测到IFNγ诱导的趋化因子CXCL9和CXCL10的血清水平升高，PSC患者的胆道上皮细胞表达CXCL9、CXCL10和IFNγ特异性转录因子STAT1和IRF1。
Mdr2-/-小鼠的多药耐药基因（Mdr2, Abcb4）被靶向破坏，已被认为是研究炎症性胆道疾病的合适模型。事实上，胆道炎症、导管增生和洋葱皮型导管周围纤维化是Mdr2-/-小鼠肝脏组织病理学的典型特征，其能够反映PSC患者肝脏中观察到的重要形态特征。磷脂翻转酶Mdr2缺失后的胆管损伤是胆道磷脂分泌缺陷的结果，这导致随后胆汁中游离胆汁酸浓度增加，因此可能具有毒性。小鼠的Mdr2基因与人类的Mdr39同源，而MDR-3基因的突变与胆道损伤有关。有趣的是，T效应细胞似乎参与了Mdr2-/-小鼠实验性硬化性胆管炎的发病机制，因为内源性调节性T细胞的扩增已被证明可以减少这些动物的胆道损伤和纤维化。
IFNγ与自身免疫有关，Th1反应与PSC相关。然而，迄今为止尚未在人类或Mdr2-/-小鼠模型中研究其功能相关性。因此，我们旨在研究其细胞来源及其在PSC小鼠模型中肝脏炎症和纤维化中的作用。我们的研究结果显示PSC患者血清中IFNγ水平升高。在Mdr2-/-小鼠中，肝脏CD8+ T细胞和自然杀伤（NK）细胞是IFNγ的主要产生细胞，IFNγ诱导的趋化因子在肝脏中的表达增强。使用Mdr2-/- x Ifng-/-小鼠，我们观察到IFNγ改变了肝脏CD8+ T细胞和NK细胞的表型，增加了细胞毒性，诱导巨噬细胞的促炎表型，加重了肝纤维化。用中和性抗IFNγ抗体治疗Mdr2-/-小鼠，证实了IFNγ对这些小鼠的纤维化作用。在PSC患者中，我们观察到肝脏CD56bright NK细胞的频率增加，并且倾向于表达细胞毒性分子TNF相关凋亡诱导配体（TRAIL）的CD56bright NK细胞。
结果
Quantification of IFNγ-producing T cells and NK cells in Mdr2-/- mice
T cell depletion reduced IFNγ production as well as liver injury in Mdr2-/- mice
Frequencies of hepatic NK cells and T cells in patients with PSC
Depletion of NK cells in Mdr2-/- mice reduced cytotoxicity of CD8+ T cells and exerted an antifibrotic effect
Genetic ablation of Ifng in Mdr2-/- mice reduced cytotoxicityof CD8+ T cells and NK cells and exerted an antifibrotic effect
讨论
在本报告中，我们分析了IFNγ在慢性胆道疾病中的作用。我们观察到PSC患者血清中IFNγ浓度的升高，其浓度范围与PBC和AIH患者血清中IFNγ水平的显著升高相似，证实了先前的结果，即PBC和AIH中存在Th1型免疫应答。此外，我们最近确定PSC患者中IFNγ诱导的趋化因子CXCL10和CXCL11的血清浓度显著升高。由于IFNγ在PSC免疫发病机制中的功能作用迄今尚未被研究，我们使用了良好的Mdr2-/-慢性胆道疾病小鼠模型，这些动物的胆道疾病先前被认为依赖于有毒胆汁酸的积累，然而，新出现的证据还表明，免疫细胞，特别是产生IL-17的T细胞亚群，在Mdr2-/-小鼠中介导肝损伤和纤维化中的作用。在这里，我们观察到，与C57Bl/6对照相比，CD8+ T细胞和NKT细胞在Mdr2-/-小鼠中产生的IFNγ数量显著增加，然而，CD8+ T细胞和NK细胞显示出产生IFNγ的细胞频率最高。与C57Bl/6对照相比，Mdr2-/-小鼠肝脏中TCRβ+ T细胞显著增加，也观察到了CD8+ T细胞和NK细胞亚群显著的增加，但CD4+ T细胞和NKT细胞也产生IFNγ。为了研究这些细胞是否有助于Mdr2-/-小鼠的肝损伤，我们使用抗CD90.2抗体去除CD90.2+细胞。
CD90.2主要由T细胞表达。我们的研究结果表明，与γδ T细胞相比，CD4+ T细胞、CD8+ T细胞和NKT细胞被抗体大量耗尽，而NK细胞的频率降低，但仍可检测到。CD90.2+细胞耗竭导致肝脏Ifng表达显著降低，但剩余NK细胞仍产生IFNγ。
有趣的是，NK细胞表达脱颗粒标志物CD107a的频率较低，这可能是IL-2和其他促炎细胞因子产生减少的结果，而IL-2和其他促炎细胞因子会诱导NK细胞的细胞毒性。结果，CD90.2+细胞耗竭后血清ALT活性显著降低。mHAI评分仅显示炎症减轻的趋势，然而，该评分的敏感性低于促炎细胞因子的定量测定，促炎细胞因子在抗体处理的小鼠中显著降低。相反，肝纤维化的发展不受T细胞缺失的影响。在Mdr2-/- x Rag-/-小鼠中观察到类似的效果，这些小鼠缺乏T细胞和B细胞，但不缺乏NK细胞。这些结果表明，T细胞是IL-2、IFNγ、IL-17和TNFα等促炎细胞因子的主要产生者，从而介导Mdr2-/-小鼠的肝损伤。然而，NK细胞产生的IFNγ残留可能导致了肝纤维化，在Mdr2-/- x Rag-/-小鼠和CD90.2+细胞耗竭后，肝纤维化也没有减少。事实上，IFNγ在实验性脂肪性肝炎中也有纤维化作用。
为了进一步阐明IFNγ在硬化性胆管炎中对NK细胞毒性和肝纤维化的作用，我们生成了Mdr2-/- x Ifng-/-小鼠。这些动物的肝T细胞和NK细胞数量减少。最引人注目的是，与Mdr2-/-鼠相比，Mdr2-/- x Ifng-/-小鼠中表达细胞毒性效应分子GzmB或TRAIL的NK细胞和CD8+ T细胞的频率显著降低。在缺乏IFNγ的情况下，淋巴细胞细胞毒性的降低可以通过观察到CD8+ T细胞的细胞毒性功能被IFNγ的自分泌增强来解释。同样，包括IFNγ在内的几种细胞因子可促进NK细胞活化。
我们进一步发现NK细胞的缺失会损害CD8+ T细胞炎症和细胞毒性分子的表达。这与先前的研究一致，表明NK细胞除了自身的细胞毒性功能外，还在病毒感染期间激活Th1和CD8+ T细胞反应，这是由NK细胞介导的树突状细胞（DC）激活触发的，激活的DC能够驱动细胞毒性CD8+ T细胞和Th1细胞极化。此外，暴露于肿瘤细胞后，NK细胞被证明会吸引DC， DC开始表达趋化因子，将效应CD8+ T细胞招募到肿瘤环境中。这一机制似乎支持NK细胞的肿瘤杀伤活性。此外，NK细胞已被证明可促进CD8+ T细胞对巨细胞病毒（CMV）的应答。在这里，NK细胞早期控制CMV，导致免疫抑制浆细胞样DC的激活受损，而传统DC被激活并加速抗病毒CD8+ T细胞反应。此外，NK细胞和CD8+ T细胞的直接相互作用已在乙型肝炎病毒（HBV）感染中得到证实。与CMV感染相反，CD8+ T细胞在慢性HBV感染期间受损，这归因于TRAIL介导的NK细胞杀死HBV特异性CD8+ T细胞，而来自同一患者的CMV特异性CD8+ T细胞未受影响。此外，慢性HBV感染患者的EB病毒和流感病毒特异性CD8+ T细胞不受NK细胞杀伤的影响。因此，NK细胞诱导的对HBV特异性CD8+ T细胞的杀伤似乎对这种病毒具有特异性。此外，已经提出了慢性感染期间HBV特异性CD8+ T细胞反应受损的其他几种机制。因此，上述研究结果表明NK细胞通过刺激和募集DC在CD8+ T细胞活化中发挥作用，你可以通过这个机制来推测在Mdr2-/-小鼠中，NK细胞也有助于CD8+ T细胞的活化。
先前的研究表明，在Mdr2-/-幼鼠中，在出生后第2周和第4周之间，CD8+ T细胞的消耗会降低ALP水平。然而，在接受肝移植的PSC患者的移植肝中，我们观察到与对照组相比，肝脏CD8+ T细胞的频率没有改变。相反，肝NK细胞，特别是那些被描述为表现出肝脏常驻表型的细胞，在PSC患者的移植肝中显著升高，显示出TRAIL表达增加的倾向。研究表明，在小鼠模型中，聚肌苷-聚胞酸或IFNγ直接激活NK细胞可诱导肝星状细胞的杀伤，并减轻肝纤维化的严重程度。然而，尽管IFNγ被描述为在体外肝星状细胞中消除促纤维化TGFβ信号，但在慢性脂肪性肝炎模型中，IFNγ缺乏可预防肝脏炎症和纤维化，这与肝脏巨噬细胞积聚减少有关。事实上，最近有研究表明，CCR2+炎性单核细胞来源的巨噬细胞介导硬化性胆管炎小鼠模型中的纤维化。由于我们在Mdr2-/- x Ifng-/-小鼠中观察到肝脏CCR2+巨噬细胞积累的抑制，因此可以想象，IFNγ通过募集炎性单核细胞来源的巨噬细胞间接加速了硬化性胆管炎的肝纤维化。
巨噬细胞被损伤相关的分子模式激活，这些模式是在肝细胞损伤的反应中产生的。我们观察到，与Mdr2-/-小鼠相比，Mdr2-/- x Ifng-/-小鼠的CD8+ T细胞和NK细胞的细胞毒性表型降低，同时对肝细胞死亡有很强的抑制作用。
在Mdr2-/-小鼠模型中，NK细胞在硬化性胆管炎发病机制中的关键作用进一步通过抑制CD8+ T细胞的炎症和细胞毒性表型以及减少NK细胞耗竭后的肝纤维化得到证实。值得注意的是，基因变异分析表明，PSC患者中抑制NK细胞受体的HLA等位基因显著减少。此外，在激活NKG2D受体的配体中也观察到遗传变异，NKG2D受体是主要的组织相容性复合体I类链相关分子MIC-A，它被认为是HLA编码的PSC疾病易感性的候选位点。事实上，我们观察到GzmB+ NK细胞在C57Bl/6小鼠中的频率相对较高，在Mdr2-/-小鼠中没有进一步增强，但在缺乏IFNγ的情况下显著降低。此外，肝脏NK细胞组成性地表达TRAIL，而TRAIL在肝脏病毒感染中被高度上调。在我们的小鼠研究中，我们证明了Mdr2-/-小鼠肝NK细胞中TRAIL的强烈上调，在Mdr2-/- x Ifng-/-小鼠中显著降低。有趣的是，PSC患者的胆管细胞表达TRAIL受体5的量增加，证明NK细胞介导了这些细胞TRAIL依赖性的裂解。此外，激动性抗TRAIL受体5抗体在小鼠中诱导胆管炎和淤胆性肝损伤，表现出与人PSC相似的典型组织学外观。因此，IFNγ可能通过增强NK细胞的细胞毒性诱导胆管细胞和/或肝细胞死亡，最终导致炎性巨噬细胞的活化和纤维化的发生。
综上所述，我们的研究表明，IFNγ依赖性免疫反应可能是硬化性胆管炎治疗干预的检查点。
