阅读最新文献，紧跟前沿进展，这是一名研究者必须具备的习惯和要求。华西医院耳鼻咽喉头颈外科的硕士、博士研究生和博士后们自2019年以来，每周开展一次文献泛读和文献精读分享会，至今已累计开展了200多次。2023年9月13日开始，华西医院耳鼻咽喉头颈外科陆续将其进行整理，同步推出在线前沿速递和文献解读板块。通过这种学习和分享的方式，使汇报者和大家都能对近期权威期刊发表的高质量研究有所了解，同时也是学习其他优秀研究者思路、方法和理论的良好手段。希望通过这种形式，把科内的分享扩大到所有的读者，一起学习，共同进步！
华西医院耳鼻咽喉头颈外科
文献精读
Immune checkpoint HLA-E:CD94-NKG2A mediates evasion of circulating tumor cells from NK cell surveillance
免疫检查点HLA-E:CD94-NKG2A介导循环肿瘤细胞逃逸NK细胞的免疫监视
期刊：Cancer Cell（IF: 50.3）
单位：四川大学华西医院生物治疗国家重点实验室石虎兵教授团队、四川大学华西医院马学磊教授
发表时间：2023年2月
摘要：由原发性恶性肿瘤脱落的循环肿瘤细胞（CTCs）在远处转移中扮演着“种子”的角色。然而，CTCs如何逃避免疫监视在很大程度上仍然是未知的。本研究对人类胰腺导管腺癌CTCs、原发性和转移性病灶的单细胞转录组进行了表征。通过体内外细胞相互作用分析和功能研究，作者发现CTCs和自然杀伤（NK）细胞通过免疫检查点分子对HLA-E:CD94-NKG2A相互作用。通过阻断NKG2A或敲低HLA-E表达来破坏这种相互作用，可以增强NK细胞介导的肿瘤细胞体外杀伤作用，并防止体内肿瘤转移。机制研究表明，血小板衍生的RGS18通过AKT-GSK3β-CREB信号通路促进HLA-E的表达，而RGS18的过表达则促进了胰腺癌的肝转移。总之，血小板衍生的RGS18通过与免疫检查点HLA-E:CD94-NKG2A结合，保护CTCs免受NK细胞介导的免疫监视。通过阻断这种抑制性信号，可以通过免疫消除CTCs来防止体内肿瘤转移。
研究背景：循环肿瘤细胞（CTCs）原发性恶性肿瘤脱落，是远处转移的“种子”。然而，CTCs如何逃避免疫监测在很大程度上仍是未知的。由于血液循环是肿瘤从原始位点向远处器官转移的主要途径，对血液中肿瘤细胞与免疫细胞之间的相互作用的研究可能提供一种治疗策略，即通过激活宿主免疫来阻断远处转移。
本文研究了：(1)在循环中移动的肿瘤细胞是否会受到免疫细胞的攻击; (2)哪种类型的免疫细胞具有免疫消除功能; (3) CTCs如何通过抑制检查点对来逃脱这种免疫监视。
为了解决这些问题，研究人员采用了一种通过血液循环进行而远处转移的典型肿瘤模型：胰腺导管腺癌（PDAC）。根据文献记载，PDAC是最致命的恶性肿瘤之一，5年生存率约为8%。患者生存率低的一个主要原因就是这种恶性肿瘤具有高度侵袭性，常向邻近器官（主要是肝脏）转移。病理和解剖学研究表明，PDAC主要通过肝门静脉（HPV）系统从胰腺原发病灶转移到肝脏。因此，来自HPV血液中的CTCs代表了循环中肿瘤细胞的中间状态。在HPV中消除CTCs可能会阻断肿瘤转移的途径。
在本文中，作者在单细胞水平上描述了血液循环和实体（原发性和转移性）恶性病变中肿瘤-免疫细胞的相互作用。通过系统分析免疫相关分子对，作者发现了一个特异性免疫检查点HLA-E:CD94-NKG2A，它介导了自然杀伤细胞（NK）免疫监测中的CTCs免疫逃逸。阻断这种相互作用可以通过恢复NK细胞毒性来阻止胰腺肿瘤的转移，这为预防CTCs介导的肿瘤转移提供了一种有效的策略。
样本及方法
1
样本
（1）接受手术或探查活检且未接受过抗癌治疗的肝转移性 PDAC 患者的原发肿瘤组织、匹配的肝转移性肿瘤病灶和 HPV 血液。
（2）从 6 名肝转移性 PDAC 患者中收集了 18 个配对样本进行单细胞 RNA-seq 和外显子组测序。
（3）收集了13份PDAC肝转移患者HPV血样，以评估微流控芯片平台和流式细胞术的捕获效率。
（4）此外，还另外收集了来自PDAC肝转移患者的13份HPV血样，以检测 EpCAM RGS18 CTC的数量，并收集相应的血小板与肿瘤细胞一起孵育。
Figure 1. Transcriptomic characterization of PDAC primary tumors, metastatic lesions, and CTCs at single-cell scale
2
造模
（1）肺转移模型：小鼠尾静脉注射肿瘤细胞
（2）人PDAC通过HPV系统远处转移的小鼠肝转移模型：通过脾脏注射人PDACs肿瘤细胞（半脾注射法）和尾静脉注射人源NKs来构建模型。在受体小鼠中，移植的NK用于消除循环中的人类PDAC。所有小鼠在肿瘤接种前一天，接受静脉注射5×106个人源性NK。对于肿瘤接种，在小鼠左肋下和腹膜上做了一个小手术切口，并在轻微的压力下暴露脾脏。通过在脾脏中心结扎 4-0 手术缝合线来划分脾脏。随后，将荧光素酶标记的1×106 个SU86.86 细胞 （SU86.86-Luc）、RGS18 过表达的 SU86.86-Luc 细胞 （RGS18-SU86.86-Luc） 或 HLA-E 敲低的 RGS18-SU86.86-Luc 细胞悬浮在 100 μL HBSS 中，注射到脾脏的一半（下极）中，然后使用同一注射器“推动”HBSS 缓冲液以冲洗接种物。将注射器留在原位 ∼30 秒，以允许注射的肿瘤细胞进入脾静脉。然后，在胰腺和脾血管之间放置 4-0 手术缝合线，并结扎脾血管。同时，切除注射的半脾，以防止原发性脾肿瘤的形成，避免脾坏死。将脾脏的左半部分（上极）返还腹腔。最后，以4-0的缝合线缝合腹膜和皮肤。两天后，额外施用剂量为 5×106人源性NK以保持体内高水平的NKs。14 d后，腹膜内注射D-荧光素钾（150 mg/kg），使用IVIS光谱成像系统分析。然后，处死小鼠，收获肝组织进行病理检查。
主要结果
1
单细胞RNA测序分析PDAC中原发性肿瘤、CTCs和转移性肿瘤组织的细胞生态系统
Figure 1. Transcriptomic characterization of PDAC primary tumors, metastatic lesions, and CTCs at single-cell scale
共获得74206个细胞的单细胞转录组数据，其中27296个细胞来自原发性肿瘤，36922个细胞来自肝转移性肿瘤，9988个细胞来自HPV血液。
基于细胞类型、组织来源和患者来源对亚群进行t-SNE图可视化，PTPR阴性(CD45-)细胞被分为上皮细胞(EPCAM+、KRT8+、KRT18+、KRT19+)，成纤维细胞(FAP+、COL1A1+、DCN+)和内皮细胞(VWF+、CDH5+、ENG+、PECAM1+)。PTPRC阳性(CD45+)细胞被进一步定义为B细胞(CD79A+、CD79B+、MS4A1+)，髓系细胞(AIF1+、CD14+、LYZ+、FPR1+)，NK细胞(KLRF1+、KLRD1+、GNLY+)和T细胞(CD3D+、CD3E+、CD3G+)。来自HPV的CTC由标记基因定义(PTPRC-、PPBP+、PF4+、CD9+、KRT8+、TIMP1+)，并采用CopyKT算法进行恶性指数CNV验证，最终共鉴定出523个CTC。具有相似的表达特征的来自不同患者和器官的内皮细胞如图聚类在一起。
2
单细胞水平上原发性、CTC和转移性PDAC的转录组特征
为了确定PDAC转移过程中转录特征的改变，作者通过CopyKAT从上皮细胞群中定义了肿瘤细胞，并将其与CTCs一起呈现。
来自实体病变的肿瘤细胞主要根据患者来源聚集，表明患者间异质性明显。差异基因表达（DGE）分析和转录组相关性分析揭示了原发性和转移性肿瘤细胞之间高度相似的表达模式，这可能归因于它们共有的驱动基因突变，如KRASG12V/D。
相反，即使来自不同的患者CTCs也落在一个集群里，与实体病变来源的肿瘤细胞很好地分离。DGE分析表明，大量血小板相关基因在CTCs中显著富集，但在实体病变的肿瘤细胞中并没有。在CTCs中前100个过度表达的基因中，有32个被鉴定为血小板相关基因。作为典型特征，在CTCs群体中观察到EMT相关基因的表达上调和上皮基因的表达缺失。此外，GPCR家族基因包括RGS18、NRGN、GNG11、CCL5等，在CTCs中显著上调，而核糖体相关基因则显著下调。
Figure 1. Transcriptomic characterization of PDAC primary tumors, metastatic lesions, and CTCs at single-cell scale
CTCs特异性特征（基因集富集分析）：包括免疫相关信号、血小板相关信号、致癌信号、细胞周期、凋亡、代谢、EMT、RNA和生物合成。
与原发性和转移性肿瘤相比，CTCs细胞群中的免疫相关特征更加活跃，这意味着CTCs和循环中的免疫细胞之间存在潜在的相互作用。
Figure 1. Transcriptomic characterization of PDAC primary tumors, metastatic lesions, and CTCs at single-cell scale
3
PDAC转移过程中的免疫监测
为了明确CTCs的特异性免疫相关行为，作者首先通过重新聚类HPV血液、原发性和转移性肿瘤中的所有CD45+免疫细胞来了解免疫细胞。
免疫细胞被分为8种淋巴系细胞亚型：NK细胞、NK-T细胞、CD8-耗竭T细胞、CD8-效应T细胞、记忆T细胞、幼稚T细胞、Treg细胞和B细胞；以及7种髓系细胞亚型：中性粒细胞、单核细胞、M1巨噬细胞、M2巨噬细胞、经典DC、血浆DC、肥大细胞。
Figure 2. Tumor-immune cellular interaction in HPV blood, primary, and metastatic tumors
为了研究直接的肿瘤细胞-免疫细胞相互作用，作者通过CellPhoneDB明确了肿瘤细胞表面配体-受体对和免疫细胞各亚型之间的分子相互作用。在原发性/转移性病变的微环境中，观察到肿瘤细胞与多种类型的免疫细胞（如CD8+T细胞、巨噬细胞、NK细胞等）之间存在复杂而强烈的相互作用。血液循环中的肿瘤免疫相互作用则相对简单。CTCs和NK细胞之间有主要的相互作用。
Figure 2. Tumor-immune cellular interaction in HPV blood, primary, and metastatic tumors
在原发病灶和转移灶中相互作用的分子对具有相当大的相似性：肿瘤细胞和耗竭T细胞之间存在强烈的共抑制或共刺激相互作用，例如LAGLS9-HAVCR2，TIGIT-PVR,和TIGIT-NECTIN2/3，意味着这可能是一种潜在的PDAC免疫治疗靶点。
在血液循环中的CTCs和免疫细胞之间观察到一种独特的免疫检查点分子对模式：在这些相互作用的分子对中，HLA-E和CD94-NKG2s被认为是CTCs和NK细胞之间最强烈的免疫相互作用。
Figure 2. Tumor-immune cellular interaction in HPV blood, primary, and metastatic tumors
4
CTCs通过免疫检查点HLA-E:CD94-NKG2A逃避NK细胞的监视
之后，作者首先展开体外验证：
NK细胞毒性试验：HLA-E的过表达可以保护PDAC SU86.86细胞免受患者来源的NK细胞在两个效应靶标下的杀伤。
Western blot显示：典型的免疫检查点信号SHP-1被抑制，而功能酶GZMB在与HLA-E缺陷肿瘤细胞共培养系统分离的NK细胞中上调。
Figure 3. Functional validations of immune checkpoint HLA-E:CD94-NKG2A in vitro and in vivo
接着在体内验证这种免疫检查点功能：
通过尾静脉注射荧光素酶标记的小鼠PDAC细胞KPC来重现CTCs介导的转移，该细胞表达人HLA-E的小鼠同源蛋白分子H2-T23。仔细测量肺内的生物发光信号，以评估肿瘤转移的强度。免疫检查点被两种替代方法阻断:(1)用阻断抗体将NKG2A封闭在NK细胞上，(2)敲除H2-T23。
为了分析抗体阻断时机对肺转移的影响，作者分别在KPC-Luc细胞接种前(第1天)、同时(第0天)和接种后(第1、3和5天)开始抗体治疗，每天一次，共注射4剂NKG2A阻断抗体。在第15天采用生物发光成像系统对肿瘤肺转移进行可视化和定量。结果表明，抗NKG2A阻断抗体能够抑制肿瘤转移，且具有时间依赖性。越早阻断NKG2A，越能有效预防肿瘤转移。在接种肿瘤前阻断NKG2A可显著防止肿瘤转移，而在0天和1天启动的阻断仅部分阻碍肿瘤转移。第3天(第3和第5天)后，NKG2A阻断不再能阻止转移。
Figure 3. Functional validations of immune checkpoint HLA-E:CD94-NKG2A in vitro and in vivo
接着在体内验证这种免疫检查点功能：通过肺形态学观察和转移瘤结节肿瘤淋巴结计数，以及H&E染色进一步验证了上述结果。
Figure 3. Functional validations of immune checkpoint HLA-E:CD94-NKG2A in vitro and in vivo
接着用敲低法来验证，发现结果一致：接种KPC细胞前抑制H2-T23的表达来阻断分子对的相互作用。与抗体阻断的结果一致，生物荧光定量、肿瘤淋巴结计数、H&E染色病理分析均显示H2-T23 (HLA-E)下调可明显缓解肿瘤细胞的肺转移。
为了验证这一免疫检查点分子对的稳定性，作者通过让具有免疫能力的小鼠C57/BL6作为受体来重复功能验证（图3N）。阻断NKG2A和敲除H2-T23都能显著提高肺转移小鼠在接种肿瘤后27天的总生存期（图3）。无论是0天或5天开始的NKG2A阻断，或者是H2-T23的下调，都不能抑制皮下异种移植肿瘤的生长。因此，以上结果表明：HLA-E:CD94-NKG2A是一个潜在的免疫检查点，介导循环中NK细胞监测中CTCs的逃避。
Figure 3. Functional validations of immune checkpoint HLA-E:CD94-NKG2A in vitro and in vivo
5
RGS18通过AKT-GSK3β-CREB1轴上调CTCs上的HLA
为了阐明CTC如何调动HLA-E表达，作者接着评估了与HLA-E表达水平潜在正相关的差异表达基因。根据基因倍数变化、p值和相关性排序，作者鉴定出一系列HLA-E相关基因，包括PPBP、PF4、NRGN、RGS18等。
将这些基因在两种PDAC细胞系（SU86.86和CFPAC-1）中过表达后，HLA-E表达水平上调，其中过表达RGS18的效应最强。
作者又通过免疫荧光染色检测了所有6例接受scRNA-seq的患者活检样本中的RGS18蛋白水平，验证了RGS18在CTCs中的上调。RGS18几乎只在CTCs中表达，而不是在原发和转移性病变的肿瘤细胞中表达（图4C）。同时，在PDAC患者合并肝转移的大型独立队列(n=13)中，在所有活检样本中都观察到RGS18+ CTCs，其比例从95%到100%不等。
Figure 4. RGS18 promotes the expression of HLA-E on CTCs via the AKT-GSK3b-CREB1 axis
然后进一步探讨RGS18是如何调节HLA-E的表达。查阅文献可得：RGS18是R4亚家族蛋白，通过Gαi和Gαq负调控GPCR信号。接着用Western Blot检测RGS18过表达的PDAC细胞中潜在的下游通路。通过检测关键激酶的磷酸化，作者发现过表达RGS18特异性地干扰了AKT通路，而不是MAPK、p38、PKC和PKA通路。RGS18上调后，AKT磷酸化水平下调。随后，GSK3β通过抑制丝氨酸残基9的磷酸化而稳定GSK3β蛋白。GSK3β通过磷酸化丝氨酸残基129增强CREB1的活性，激活的CREB1显示出细胞核的亚细胞定位。
Figure 4. RGS18 promotes the expression of HLA-E on CTCs via the AKT-GSK3b-CREB1 axis
（查阅文献发现）在细胞核中，CREB1与RFX和NFY形成转录正调控复合物，结合HLA-E的启动子结构，该结构由完整的SXY基序和不完整的增强子A和ISRE位点组成。（前面结果显示）RGS18过表达上调了三种PDAC细胞系中的HLA-E水平，而CREB1的下调显著下调了HLA-E的表达。
敲除RGS18验证：敲除RGS18可增强AKT的磷酸化并使GSK3β不稳定。随后，它使CREB1失活并下调HLA-E的表达。
AKT突变体验证：通过两种活化突变体AKTE17K和AKTQ79K在PDAC细胞中搅动AKT信号通路可抑制GSK3β，下调CREB1，进而降低HLA-E的表达。
综上所述，信号通路探索表明RGS18通过AKT- GSK3β-CREB1轴促进HLA-E的表达。
接着再验证RGS18的促转移功能。脾内注射荧光素酶标记的SU86.86 PDAC细胞，进行肝门静脉系统肝转移造模。在小鼠中接种过表达RGS18的SU86.86细胞后，通过生物发光图像显示肝转移主要发生部位，并通过信号定量。对照组小鼠接种空白载体的SU86.86细胞，未见明显肝转移。同样地，在接种了人RGS18 (hRGS18)过表达PDAC细胞的小鼠肝脏中发现了严重的转移性肿瘤，而在对照组中没有。H&E染色和免疫组化进一步证实了这一结果。RGS18过表达显著降低了肝转移小鼠的总生存率。
Figure 5. RGS18 promotes the liver metastasis of PDAC tumor cells
与肝转移相关，生物发光成像和信号定量结果显示mRGS18（鼠RGS18）通过上调H2-T23（小鼠KDC细胞系中自带的人HLA-E的小鼠同源蛋白分子H2-T23）显著促进肺转移。在肿瘤接种前1天开始注射4天NKG2A阻断抗体可抑制肿瘤转移。肿瘤淋巴结计数和H&E染色进一步证实了这一结果。
综上所述，这些数据表明RGS18通过上调CTCs中抑制性免疫检查点HLA-E而在促进肿瘤转移中发挥关键作用。
Figure 5. RGS18 promotes the liver metastasis of PDAC tumor cells
6
CTCs通过吸收血小板获得RGS18
（查阅文献+自己结果）CTCs通常被血小板覆盖，血小板是RGS18蛋白的主要来源。除RGS18外，CTCs的scRNA-seq数据中还特异性观察到PPBP、PF4等血小板相关基因。因此，推测CTCs中的RGS18可能来源于粘附血小板。通过共聚焦显微镜在HPV中的CTCs上观察到血小板不仅粘附在CTCs上，而且还出现在CTCs里面。PDAC患者血小板出现细胞内定位(红色)，而来自健康供体的血小板不能被内化。使用流式细胞术对荧光信号进一步定量，结果表明患者来源的血小板被肿瘤细胞以剂量依赖的方式内化。
然后，使用小鼠PDAC细胞系KPCs孵育人血小板，并通过特定引物的RT-qPCR检测供体(人)和宿主(小鼠)RGS18的mRNA水平。结果表明，人RGS18 mRNA呈剂量依赖性上调。与从PDAC患者中分离的血小板孵育后，在SU86.86和CFPAC-1中，RGS18和HLA-E水平均以剂量依赖方式上调。综上结果表明，CTCs获得了血小板来源的RGS18, RGS18通过AKT-GSK3β-CREB信号通路上调HLA-E的表达。上调的HLA-E与NK细胞上的CD94-NKG2A相互作用，作为免疫检查点对抑制循环中的CTC的免疫监测。
Figure 6. CTCs obtain RGS18 by internalization of platelets
总结
Figure 7. Schema of HLA-E:CD94-NKG2A-mediated evasion of CTCs from NK cell immune surveillance
只要CTCs进入血管，它们就会粘附并吸收携带RGS18的血小板。RGS18抑制宿主细胞中磷酸化AKT的激活，通过抑制GSK3β Ser9位点的磷酸化来稳定GSK3β蛋白。GSK3β蛋白通过在CREB1 Ser133位点磷酸化促进CREB1的核易位。CREB1结合细胞核内HLA-E基因启动子区SXY位点，上调CTCs表面HLA-E的表达和易位。细胞表面HLA-E与NK细胞上的CD94-NKG2A相互作用，激活细胞内磷酸酶SHP-1，抑制NK细胞的细胞毒活性。
▶ 往期推荐
第43期：文献精读丨利用体内工程化巨噬细胞重塑肿瘤微环境以根除肝转移瘤
第42期：文献精读丨非小细胞肺癌的单细胞和空间转录组学分析
第41期：文献精读丨循环代谢生物标志物的全基因组特征分析
内容转载自公众号【华西医院耳鼻喉科】。每期资料内容均为“华西医院耳鼻喉科”原创，授权新媒体“耳鼻咽喉资讯”发布，其他网络媒体转载，请联系客服微信：13061869150！
内容属于专业医学知识
仅面向医学相关工作、学习人员观看
下载APP丨获取更多资讯
