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内容来源于Goulab
2024年8月19日本草合成生物学团队在国际期刊《The Plant Journal》（中科院一区TOP期刊，IF：6.2）接收题为“Biosynthesis of bridged tricyclic sesquiterpenes in Inula lineariifolia”的文章。
线叶旋覆花（Inula lineariifolia），也被称为“金沸草”，是中国分布广泛的菊科旋覆花属多年生药用植物，具有抗炎、抗肿瘤和抗菌活性，富含丰富的倍半萜类化合物，它们在制药和农业中得到广泛应用。其中presilphiperfolane型倍半萜类是一类受到广泛关注的倍半萜类化合物，由于其罕见的 5/5/6 三环碳骨架结构，这些化合物主要存在于菊科植物如旋覆花中，数量有限，限制了对其深入研究和开发利用。合成生物学的兴起为利用微生物底盘大量异源合成这些稀有倍半萜类化合物提供了新途径，但实现这一目标的首要条件是需要阐明参与其生物合成的酶。为了实现presilphiperfolane型倍半萜化合物的生物合成及对其开发利用，在本研究中，我们利用转录组学鉴定了一个线叶旋覆花中 presilphiperfolane 型倍半萜合成酶基因，命名为 IlTPS1；系统进化分析表明 IlTPS1与菊科三环萜烯合成酶 MrTPS2和AabrSPS进化高度保守。生化功能分析表明 IlTPS1 是一个多功能的倍半萜醇合酶，它催化法尼基焦磷酸（FPP）生成 7 种不同的倍半萜化合物。质谱和核磁共振试验证实桥连三环倍半萜化合物 presilphiperfolan-8β-ol 和 presilphiperfol-7-ene 为其主要酶促产物。生物学活性试验表明 IlTPS1 的催化产物对稻黑孢真菌Nigrospora oryzae T46 有显著的抑菌活性。我们的研究代表了一个重大的进步，因为它不仅从功能上鉴定了倍半萜合成的第一步酶，而且建立了这些独特倍半萜化合物的异源生物合成，并明确了其作为杀菌剂的潜力。2.1 Prephiperfolanes倍半萜化合物及关键酶IlTPS1的发现
为了鉴定旋覆花中的主要挥发性倍半萜化合物，我们借助扫描电镜和GC-MS从旋覆花花冠的腺毛细胞中共鉴定出13种挥发性倍半萜类化合物，有4种化合物含量最多，其中，Peaks 1, 3, 7为prephiperfolanes倍半萜化合物（图1）。
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图1 旋覆花腺毛细胞中倍半萜烯化合物
为了鉴定Prephiperfolanes倍半萜化合物生物合成的相关基因，我们进行了旋覆花花粉管转录组学测序，筛选到1条高表达量且具有完整ORF的基因，命名为IlTPS1，作为关键候选基因。系统发育分析表明，IlTPS1归属于TPS-a亚家族，与两个菊科三环倍半萜合酶基因AabrSPS和MrTPS2紧密聚为一簇，表明IlTPS1也可能有三环倍半萜合酶的功能（图2）。![]()
为了表征IlTPS1的催化功能，我们在原核系统中表达并纯化了IlTPS1重组蛋白，将纯化的蛋白与底物FPP（法尼基焦磷酸）进行体外酶促实验，结果表明IlTPS1将FPP催化生成至少7个不同的产物，且与花粉管中鉴定的化合物一致。进一步通过NMR实验，确定了IlTPS1催化的主产物Peak 7为presilphiperfolan-8β-ol（图3）。
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2.2 Prephiperfolanes倍半萜化合物的异源合成
为了实现prephiperfolanes倍半萜化合物的异源合成，首先我们在酵母系统中表征了IlTPS1，结果显示在酵母系统中IlTPS1能催化生成12个倍半萜化合物；摇瓶发酵96h, 主要催化产物presilphiperfolan-8β-ol最大滴度为111.19 mg L-1。5 L发酵罐补料发酵96h，主要催化产物presilphiperfolan-8β-ol peak 7滴度为413.85 mg L-1。
我们也尝试在烟草系统中异源合成三环倍半萜化合物。首先，在烟草系统中表征IlTPS1，结果显示IlTPS1能催化生成7个化合物 (peaks 1-7)，与体外反应结果一致。其次，我们采样代谢工程策略分别或同时过表达MEP和MVA途径中关键基因DXS和HMGR，结果发现均能够增加三环倍半萜化合物的含量，同时过表达两个上游关键基因时产量最高，约为30 μg g-1 FW，其含量是单独过表达tHMGR或PbDXS时的5倍和1倍（图4）。
上述结果表明，酵母株EPY300:: PESC-Ura-IlTPS1A14P,Y448H和烟草系统中IlTPS1同时过表达tHMGR，PbDXS都可以用于生产桥连三环倍半萜类化合物。![]()
图4 酵母和烟草系统中异源合成IlTPS1催化产物2.3 Prephiperfolanes倍半萜化合物的开发利用
为了探究IlTPS1催化的prephiperfolanes倍半萜化合物的生物学功能，我们开展了抑菌活性试验，结果表明，IlTPS1催化的产物对稻黑孢菌，尤其是N. Oryzae T46具有显著的的抑制作用（图5），说明IlTPS1催化产生的倍半萜类化合物具有开发为生物农药的潜力。![]()
湖北中医药大学本草合成生物学团队博士生吴迎梅、深圳护家科技有限公司陈雪青博士、中科院物数所豪富华副研究员为论文共同第一作者，苟君波教授为通讯作者。
本项目得到了国家重点研发计划(2018YFA0901800)、湖北省自然科学基金(2023AFD121)、湖北中医药大学重大攻关项目(2023ZDXM007)、加拿大自然科学工程研究委员会基金(RGPIN-2017-04874) 、国家自然科学基金(32370427，32272506)、云南省科学基金(202105AF150028)、中国博士后科学基金(2019M650912)、深圳市科技与创新委员会基金(JCYJ20190813141601661)的支持。
中国热科院黄三文研究员、云南师范大学尚轶教授、加拿大卡尔加里大学Dea-kyun Ro教授、上海大学章焰生教授提供了指导。
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