采用反相色谱法分离弱酸（3≤pKa≤7）或弱碱（7≤pKa≤8）样品时，通过调节流动相的pH值，以抑制样品组分的解离，增加组分在固定相上的保留，并改善峰形的技术称为反相离子抑制技术。
对于弱酸，流动相的pH值越小，组分的k值越大，当pH值远远小于弱酸的pKa值时，弱酸主要以分子形式存在；对弱碱，情况相反。分析弱酸样品时，通常在流动相中加入少量弱酸，常用50mmol/L磷酸盐缓冲液和1%醋酸溶液；分析弱碱样品时，通常在流动相中加入少量弱碱，常用50mmol/L磷酸盐缓冲液和30mmol/L三乙胺溶液。
注：流动相中加入有机胺可以减弱碱性溶质与残余硅醇基的强相互作用，减轻或消除峰拖尾现象。所以在这种情况下有机胺（如三乙胺）又称为减尾剂或除尾剂。
(三乙胺triethylamine 氨分子中的氢原子被3个乙基取代的产物。分子式(CH3CH2)3N。易挥发的无色液体，有氨的气味。熔点－114.7℃，沸点89.3℃，相对密度0.7275（20／4℃）。
溶于水和乙醇、乙醚等有机溶剂。三乙胺有碱性，与无机酸能生成易溶于水的盐类。可由N，N- 二乙基乙酰氨与氢化铝锂反应制取，也可用乙醇胺进行气相烷基化反应合成。用于制橡胶硫化促进剂、润湿剂和杀菌剂等，也可用作溶剂和用于合成四级铵化合物。)
HPLC所用流动相必须预先脱气，否则容易在系统内逸出气泡，影响泵的工作。气泡还会影响柱的分离效率，影响检测器的灵敏度、基线稳定性，甚至使无法检测。（噪声增大，基线不稳，突然跳动）。此外，溶解在流动相中的氧还可能与样品、流动相甚至固定相（如烷基胺）反应。溶解气体还会引起溶剂pH的变化，对分离或分析结果带来误差。
溶解氧能与某些溶剂（如甲醇、四氢呋喃）形成有紫外吸收的络合物，此络合物会提高背景吸收（特别是在260nm以下），并导致检测灵敏度的轻微降低，但更重要的是，会在梯度淋洗时造成基线漂移或形成鬼峰（假峰）。在荧光检测中，溶解氧在一定条件下还会引起淬灭现象，特别是对芳香烃、脂肪醛、酮等。在某些情况下，荧光响应可降低达95%。在电化学检测中（特别是还原电化学法），氧的影响更大。
除去流动相中的溶解氧将大大提高UV检测器的性能，也将改善在一些荧光检测应用中的灵敏度。常用的脱气方法有：加热煮沸、抽真空、超声、吹氦等。
对混合溶剂，若采用抽气或煮沸法，则需要考虑低沸点溶剂挥发造成的组成变化。
超声脱气比较好，10~20分钟的超声处理对许多有机溶剂或有机溶剂/水混合液的脱气是足够了（一般500ml溶液需超声20~30min方可），此法不影响溶剂组成。超声时应注意避免溶剂瓶与超声槽底部或壁接触，以免玻璃瓶破裂，容器内液面不要高出水面太多。
离线（系统外）脱气法不能维持溶剂的脱气状态，在你停止脱气后，气体立即开始回到溶剂中。在1~4小时内，溶剂又将被环境气体所饱和。
在线（系统内）脱气法无此缺点。最常用的在线脱气法为鼓泡，即在色谱操作前和进行时，将惰性气体喷入溶剂中。严格来说，此方法不能将溶剂脱气，它只是用一种低溶解度的惰性气体（通常是氦）将空气替换出来。此外还有在线脱气机。
一般说来有机溶剂中的气体易脱除，而水溶液中的气体较顽固。在溶液中吹氦是相当有效的脱气方法，这种连续脱气法在电化学检测时经常使用。但氦气昂贵，难于普及。
PART.01
理论部分
pH
对于可电离的化合物，要获得最强的反相保留，分析物应尽可能的不带电或电离，此时分析物极性相对较小，在反相色谱柱上的保留就更强，中性化合物无任何可电离基团，不受pH影响。
酸性和碱性化合物在其未电离状态下时反向保留最大，中性化合物的保留不受pH影响。
在选择流动相时，应避免在化合物分子的pKa值附近筛选pH条件，否则，pH值的微小变化都会导致保留和选择性的剧烈变化。
保留曲线的平台区是分析方法耐用性较强的区域。
流动相中有盐时，应确保盐不会析出。
缓冲盐
需要考虑缓冲盐的范围，根据pH选择合适的缓冲盐，常用缓冲盐及缓冲能力如下表：
有机相洗脱能力
甲醇和乙腈是反相分离的常用典型有机溶剂，除了洗脱强度、粘度（与柱背压有关）、紫外吸收性不同，甲醇与乙腈在化学选择性上也有所不同，甲醇可以发生氢键作用因此会提供显著不同的选择性。
溶剂强度顺序：
水＜甲醇＜乙腈＜乙醇＜四氢呋喃＜丙酮＜二氯甲烷
其中二氯甲烷和水不互溶，其余和水互溶。
TIPS:根据实际情况，有时使用混合流动相会有很好的效果！
溶剂之间的互溶性
我们选择的流动相、配制样品的稀释剂一定要是互溶的。经典的溶剂之间互溶表如下：
溶剂效应
产生原因：溶解样品的溶剂强度大于流动相
现象：拖尾、裂分
优化：使用与初始流动相比例接近的溶剂，减小进样量，增大样品浓度
PART.02
案例部分
ACN与甲醇不同洗脱强度带来分离效果不同
A项目样品主峰前有一未知杂质，技术员提出疑问通过硅胶点板确认样品存在未知杂质
目的：分离该杂质
将有机相由ACN换成甲醇后，主峰与未知杂质分离
甲醇与苯基柱组合带来更好地分离效果案例
问题描述：ACN洗脱能力过强，使A项目中的IM3、IM4重叠
将流动相换成甲醇后，IM3和IM4成功分离：
心得分享：
该方法中色谱柱为X-Bridge Phenyl (4.6x150mm, 3.5μm)，该型柱与MeOH搭配效果好于与ACN搭配效果
使用MeOH能更好体现苯基的Π-Π选择性，ACN中的Π电子干扰了样品中苯环与苯基固定相的结合，削弱了其分离效果。
