JAFC丨天津大学化工学院元英进院士团队系统工程提高酿酒酵母中8-羟基香叶醇产量

8-羟基香叶醇是一种重要的昆虫性信息素和防御分泌物的组成成分，同时也是单萜吲哚生物碱（MIA）生物合成的前体。8-羟基香叶醇通过甲羟戊酸(MVA)途径形成的香叶醇焦磷酸(GPP)被香叶醇合成酶(GES)水解为香叶醇。然后，香叶醇被P450香叶醇-8-羟化酶(G8H)氧化为8-羟基香叶醇。据报道，Dusseaux等人从酿酒酵母中合成的香叶醇滴度为5.52 g/L。然而8-羟基香叶醇在酿酒酵母中的最高滴度仅为92.8 mg/L/OD₆₀₀(OD600≈5−6)，说明G8H催化香叶醇转化为8-羟基香叶醇是该反应的限速步骤。

G8H属于p450s的CYP76亚家族II类，P450的催化过程需要细胞色素P450还原酶(CPR)协助和参与P450的电子转移，因此P450与CPRs之间的相容性至关重要。Davies等人证实，筛选G8H/CPR组合可优化8-羟基香叶醇的合成。此外，大多数P45定位于内质网(ER)，扩大内质网的大小可以允许更多的P450酶附着。Kim等通过过表达内质网大小调节因子INO2，将角鲨烯和三萜的产量分别提高了71倍和8倍3002此外，还原性烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP⁺)也是P450酶G8H的辅因子，是烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)的还原型。因此，增加NADPH的供给也可能促进8-羟基香叶醇的生物合成。Shi等引入ZWF1基因增加NADPH供应，使菊内酯滴度提高75.28%。因此，此研究的关键是如何提高P450香叶醇-8-羟化酶（G8H）的催化效率。

图1  8-羟基香叶醇生物合成的代谢途径及系统工程策略

此研究使用的初始酵母菌yJGZ117是一个敲除GAL80的香叶醇生产平台，在该平台中，使用的可诱导的GAL启动子可以在葡萄糖耗尽时自动诱导。因此，生长和生产阶段是分开的。为了获得8-羟基香叶醇，将来源于长春花的G8H和CPR引入yWHR01中，生成yWHR02。菌株yWHR02能够将香叶醇转化为8-羟基香叶醇，通过气相色谱保留时间和质谱片段证实了这一点。质子化离子扫描结果表明，8-羟基香叶醇标准品与菌株yWHR02的产物具有相同的m/z峰。

研究发现，筛选P450和CPRs的不同组合以获得最佳的P450组合对P450s的催化效率至关重要。选择萝芙木(RsG8H)、长春花(CrG8H)、小蔓长春花(VmG8H)、白茉莉(AhG8H)、黄金鸡纳(CcG8H)、獐牙菜(SmG8H)、金银花(LjG8H)以及长春花来源的tCrCPR和拟南芥来源的基因进行组合表达。所有的G8H基因在GAL7启动子控制下克隆到质粒pRS415中，所有的CPR基因在GAL1启动子控制下克隆到质粒ygg416中。当与tATR1配对时，8羟基香叶醇产量在除了携带SmG8H外的不同G8Hs菌株中的滴度明显高于携带tCrCPR的菌株，说明还原酶对G8H的催化效率有显著影响。有趣的是，虽然在长春花中发现了8-羟基香叶醇的生物合成途径，但CrG8H与tCrCPR的组合并没有表现出更好的活性。Davies等证明CrG8H在酿酒酵母中表现出比其他G8Hs(不含LjG8H)更好的催化活性，这可能是由于不同的底盘背景造成的。LjG8H与tATR1结合的效果最好，8-羟基香叶醇滴度为51.11 mg/L。此外，使用多拷贝质粒pRS425K过表达LjG8H，但滴度显著下降。因此，选择含有LjG8H和tATR1的菌株yWHR15进行进一步优化。

图2  8-羟基香叶醇产酵母菌株的构建

图3  利用不同的G8H和还原酶组合生产8-羟基香叶醇

内质网的功能主要是支持靶蛋白的正常折叠，协助蛋白质正确折叠。INO2是脂质生物合成的正调节因子，对酵母诱导膜的形成至关重要。Kim等人通过过表达INO2来改造酿酒酵母，以扩大内质网并缓解酶丰度有限所造成的代谢限制。PAH1是另一个参与调节内质网大小的重要基因。Zhao等通过删除PAH1增加了β-胡萝卜素的产量。考虑到PAH1在全细胞脂质代谢中也有重要作用，除了敲除PAH1外，还选择通过启动子P_HXT1下调PAH1来微调内质网大小。因此，分别构建了通过启动子P_HXT1下调PAH1、通过GAL启动子敲除PAH1和过表达INO2的菌株yWHR18、yWHR19和yWHR20。此外，为了量化ER工程对LjG8H表达的影响，还将RFP融合到LjG8H的C端，生成yWHR21、yWHR22、yWHR23和yWHR24。观察到LjG8H在yWHR23中的表达也显著增强。同样，通过破坏PAH1，8-羟基香叶醇的产量也提高了30%，达到67.29 mg/L (p<0.01)。用启动子PHXT1下调PAH1的菌株对8-羟基香叶醇产量的增强作用较弱(p<0.05)。

图4  通过扩大ER面积提高8-羟基香叶醇的产量

Shi等报道，当内质网大小显著增大时，细胞生长受到损害，PAH1被敲除时也观察到类似的现象。DGK1编码的二酰基甘油激酶负责二酰基甘油(DAG)转化为磷脂酸(PA)。敲除菌株yWHR25的DGK1后，细胞生长几乎恢复，但对8羟基香叶醇产量无显著影响。Zhang等人还发现，DGK1−PAH1双敲除可阻断PA向DAG的转化，这可能导致PA水平升高，从而导致磷脂酰丝氨酸(PS)、磷脂酰乙醇胺(PE)和磷脂酰胆碱(PC)的生物合成增加。考虑到菌株的稳定性，将LjG8H和tATR1整合在DGK1位点，进一步提高滴度至82.9 mg/L。内源性还原酶OYE2和OYE3负责将包括香叶醇和8-羟基香叶醇在内的几种中间体转化为多种分流产物，分别单独敲除，得到菌株yWHR27和yWHR28。8-羟基香叶醇滴度分别提高了17%和18%。出乎意料的是，OYE2-OYE3双敲除菌株导致8-羟基香叶醇产量显著下降，这可能是由于过度敲除还原酶，并可能破坏酵母的氧化还原平衡。另一个LjG8H拷贝被整合到菌株yWHR27的染色体上，但对8-羟基香叶醇的产生没有积极影响。由于菌株yWHR27和yWHR28的8-羟基香叶醇滴度无显著差异，选择这两个菌株进行进一步优化。

P450催化的反应需要辅因子的供给，NADP⁺的还原状态NADPH是G8H的重要辅助因子。NADH激酶(POS5)可将NADH转化为NADPH，而葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(ZWF1)负责从6-磷酸D-葡萄糖醛酸到6-磷酸D-葡萄糖醛酸1,5-内酯的反应，可以将NADP⁺转化为NADPH。先前的研究表明，过表达POS5和ZWF1可有效增加NADPH的可用性，维持细胞内辅因子平衡。为了促进NADPH再生，将PTDH3P控制下的POS5和ZWF1基因分别导入yWHR27和yWHR28作为对照，得到4个菌株yWHR32、yWHR33、yWHR35和yWHR36。将带URA标记的空质粒pRS426K导入yWHR27和yWHR28中，分别得到菌株yWHR31和yWHR34。以菌株yWHR31和yWHR34为对照，分别研究添加NADPH对oye2缺失菌株和oye3缺失菌株8-羟基香叶醇产量的影响。与对照相比，8-羟基香叶醇在yWHR32、yWHR33、yWHR35和yWHR36中的滴度提高了近25%，表明POS5和ZWF1过表达确实促进了8-羟基香叶醇的合成。

考虑到菌株的稳定性，通过同源重组将POS5和ZWF1基因同时整合到菌株yWHR27和yWHR28的染色体上，分别产生菌株yWHR37和yWHR38。与yWHR27和yWHR28相比，yWHR37和yWHR38分别提高了8-羟基香叶醇的滴度。整合了POS5和ZWF1的菌株yWHR37的8-羟基香叶醇滴度最高，为158.1 mg/L。

图5  再生NADPH提高8-羟基香叶醇产量

为了进一步提高8-羟基香叶醇滴度，在菌株yWHR37中删除了ADH6和ARI1，阻断了8-羟基四氢香叶醇的分流产物途径，从而产生菌株yWHR39。如图所示，8-羟基香叶醇滴度提高到190.9 mg/L。此外，将营养缺陷标志物URA补充到yWHR39中，得到滴度为238.9 mg/L 8-羟基香叶醇的yWHR40。因此，选择yWHR40进行后续补料分批发酵。如图所示，发酵144 h收获，细胞密度为70，共消耗葡萄糖67 g，乙醇158 g。最后，8羟基香叶醇产量达到1.025 g/L。与摇瓶水平相比，8-羟基香叶醇滴度提高了3.29倍。乙醇对8-羟基香叶醇的收率为1.62%。

图6  菌株yWHR040在5 L生物反应器中补料分批发酵