β-烟酰胺单核苷酸（NMN）是人及哺乳动物NAD+的关键前体。研究表明NMN可显著改善小鼠年龄相关的生理恶化并可逆转线粒体功能障碍，缓解高脂肪饮食引起的II型糖尿病，并在临床试验中增强人类骨骼肌中的葡萄糖代谢。当前，NMN已被广泛认为是一种具有重要生理调节功能的分子，并被用于制药、食品和化妆品添加剂领域。因此，开发绿色安全、高效高产及具有成本优势的NMN生物合成工艺具有重要的价值。
图1 代谢工程策略用于NMN的半生物合成和从头生物合成
NMN半生物合成异源途径的构建
为了实现NMN的半生物合成，作者通过遗传改造毕赤酵母细胞，分别引入三种来源不同的Nampt酶，包括松茸（Chitinophaga pinensis）、小鼠（Mus musculus）和杜克氏嗜血杆菌（Haemophilus ducreyi）。实验结果表明，在补充0.5 g/L NAM（烟酰胺）的条件下，来自松茸的Nampt-CP在96小时后的NMN产量最高，达到13.3 mg/L。此外，通过共表达NAM和NMN的转运蛋白NiaP与PnuC，进一步提升了NMN的合成效率。特别是，当Nampt-CP表达菌株额外表达PnuC后，NMN产量提高了9%，达到14.5 mg/L。为了进一步增强NMN的产量，通过敲除毕赤酵母中四个关键代谢基因来阻断NAM和NMN的代谢消耗路径。结果显示，四基因敲除菌株（CPN4Δ）在96小时后NMN的产量达到56.9 mg/L，是未敲除菌株产量的2.9倍。
图2 通过遗传改造毕赤酵母细胞实现NMN的半生物合成
NMN从头生物合成的设计与构建
为了实现NMN的从头生物合成，作者选用了Δku70Δ0361Δ0598Δ0359Δ0685四基因敲除菌株作为宿主，该菌株在不影响生长的前提下增加了内源性NMN的积累（从7.1 mg/L提升至11.1 mg/L）。通过引入一条从分支酸（chorismate）到喹啉酸（quinolinic acid, QA）的异源途径，异源表达PhzE、PhzD、DhbX和NbaC基因，并过表达QA磷酸核糖转移酶（NadC）和NMN合酶（FtNadE），成功构建了从基本碳源合成NMN的高效途径，使NMN在24 h内产量达到31.9 mg/L。然后，对前体供应途径进行优化，选取反馈不敏感的突变体Aro3K222L，在高产菌株中进行过表达，使NMN的产量在48小时内达到36.9 mg/L，是未优化Δku70菌株的4.9倍。此外，采用乙醇作为碳源，NMN产量进一步提高到57.9 mg/L，比使用葡萄糖时高60%。
图3 在工程化酵母细胞中构建异源合成途径实现NMN的从头生物合成
生物反应器中通过半合成和从头生物合成生产NMN
在3-L反应器中，作者分别采用半生物合成和从头生物合成两种策略进行NMN的生产。对于半生物合成，作者使用CPN4Δ-VP菌株，在消耗了约1 g/L的NAM和868 g的葡萄糖后，在165小时NMN的产量达到1004.6 mg/L。相比之下，从头生物合成的4ΔNNPPD2NPPA菌株在91小时内生产出980.4 mg/L的NMN，同时合成了120 mg/L的NAM作为副产物，消耗了160 g的葡萄糖和557 g的乙醇。相关结果证明了巴斯德毕赤酵母从头生物合成NMN的潜力，并显示乙醇作为基础碳源用于NMN生物合成的优势。相关工作为工程酵母细胞工厂进一步优化合成NMN提供了新的参考，鉴于乙醇可通过非粮碳源可再生合成，因而也为可再生碳源合成NMN（如用于动物、宠物领域）提供了概念验证，对于推动可持续生物制造具有一定的参考意义。
图4 在生物反应器中评估半生物合成和从头生物合成NMN的性能
原文链接：
https://enviromicro-journals.onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/1751-7915.70048
感谢华东理工大学蔡孟浩教授团队对本号的支持，感谢该课题组提供本文稿件支持!
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编辑 | 王咏桐
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