中文题目：具有细胞穿透肽的工程噬菌体用于细胞内细菌感染
期刊及年份：mSystmes，2024
通讯作者：余加林，重庆医科大学附属儿童医院新生儿科，国家儿童健康与障碍临床研究中心。马迎飞，中国科学院深圳先进技术研究院，主要研究微生物组、噬菌体组、噬菌体合成生物学以及应用噬菌体防治耐药菌的应用研究。
摘要：沙门氏菌感染对全球公共卫生构成了严峻挑战，并且随着抗生素抗性的增加，这一情况愈发严重。噬菌体（phages）由于能够杀死特定细菌，正越来越多地被用作抗菌剂。然而，噬菌体的低细胞摄取率限制了它们在治疗细胞内细菌感染中的使用。在这里，我们构建了一种带有细胞穿透肽（CPPs）的工程噬菌体来增强噬菌体进入细胞的效率，以抑制胞内细菌感染。生物信息学分析鉴定到一种含有免疫球蛋白样（Ig-like）结构域的噬菌体编码蛋白，可作为噬菌体展示的潜在靶标。使用基于CRISPR-Cas9的方法，我们成功地在Salmonella噬菌体selz的含有Ig样结构域的蛋白GP94上展示了短肽。我们通过将不同类型的CPPs融合到GP94上来提高噬菌体在多种细胞类型中的细胞内摄取。值得注意的是，噬菌体selzHA-TAT在抑制Salmonella细胞内感染方面显示了有希望的结果。我们的研究提供了一种直接的策略，在非模型噬菌体上展示CPPs，为治疗细胞内耐药细菌提供了一种有前途的新颖和有效的治疗方法。
主要内容
图1展示了筛选和验证噬菌体蛋白候选肽展示的实验设计。A 部分是这项研究中基因编辑策略的示意图。噬菌体selz的基因组注释中，开放阅读框（ORFs）的颜色代表五个不同的功能模块：结构和包装、宿主裂解、DNA复制和修饰、其他功能、未知功能。GP94蛋白由点线标出。Avi标签（绿色）或金结合肽（GBP，浅绿色）直接融合在GP94的N端，而细胞穿透肽（CPPs，色）与2xG4S连接子（橙色）一起在GP94的N端（粉色）连接。B 部分展示了使用AlphaFold2预测的蛋白GP94的结构图。C 部分描述了使用特定引物鉴定重组噬菌体selzavitag和selzGBP的方法。D 部分描述了在聚偏氟乙烯（PVDF）膜上使用辣根过氧化物酶（HRP）标记的链霉亲和素进行的西方印迹分析。E 部分展示了野生型selz噬菌体（左侧）和带有10纳米金纳米粒子的selzGBP（右侧）的透射电子显微镜（TEM）图像。比例尺为100纳米。
表1提供了细胞穿透肽（CPPs）的氨基酸序列信息
FIG 2 Cellular uptake of WT and engineered selz phage in different cell lines. Phages were incubated with Hela (A), A549 (B), and Caco-2 (C) cells (80%–90% confluence) at 1.5 × 109PFU for 4 h. Cells were washed with phosphate-buffered saline (PBS) buffer four times, lysed by ddH2O, and then functional phages were quantified using plaque assay. Data are presented as median with interquartile range (IQR) of the results from two independent experiments (n = 6–8, ****P < 0.0001, ***P < 0.001, *P < 0.05, the comparison was exclusively performed between individual engineered phage and WT selz phage). (D) Time course of WT selz and selzHA-TAT phages internalization into A549 cells. Following incubation with AF488 NHS-labeled phages (green) for the time indicated at 37°C, the non-internalized phages were stripped off with PBS containing 0.5 mg/mL heparin sulfate. (E) Phage clusters in early-endosomal/lysosomal compartments. A549 cells were incubated with AF488 NHS-labeled selzHA-TAT phages (green) for 2 h and 4 h at 37°C, extracellular phages were removed by heparin sulfate, and the fixed cells were immunostained for the early-endosomal marker [early endosome antigen 1 (EEA1)] (red), and nuclei were stained with 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) (blue). The lysosomal staining dye LysoTracker Red and cell nuclei stain Hoechst (blue) were added to the medium 20 min before the end of incubation with phage. Representative images from two to four biological replicates are shown. Scale bar, 20 μm. (F) Quantification of phage clusters positive for EEA1 or LysoTracker. Following incubation with AF488 NHS-labeled phages for 2 h or 4 h at 37°C. The data represent the mean ± standard deviation of two independent experiments depicting the results from at least 200 cells for each condition.
图2为了研究CPPs是否增加了噬菌体selz对哺乳动物细胞的吸收，ABC图展示了在不同细胞系（Hela、A549 和 Caco-2细胞）中，野生型（WT）和工程改造型selz噬菌体的细胞摄取情况。细胞与噬菌体共孵化4小时后，使用PBS缓冲液洗涤四次，并通过ddH2O裂解细胞，然后使用噬菌斑分析法定量活性噬菌体。D展示了WT selz和selzHA-TAT噬菌体在A549细胞中的内化过程。细胞与AF488 NHS标记的噬菌体（绿色）共孵化后，使用含有0.5 mg/mL肝素硫酸盐的PBS去除未内化的噬菌体。与WT selz相比，selza - tat检测到绿色荧光信号明显增强(图2D)。对于selza - tat，孵育1 h后，细胞内开始出现荧光噬菌体簇，其数量增加至24 h(图2D)。E为了确定内化的噬菌体颗粒是否通过内溶酶体途径穿梭，利用A549细胞共聚焦显微镜观察最有希望的工程噬菌体selza - tat。展示了噬菌体在早期内质体/溶酶体中的聚集情况。对噬菌体孵育的细胞进行早期内体(EEA1)和晚期内体/溶酶体(LysoTracker，嗜酸染料)染色。2 h后，大多数噬菌体在晚期内体/溶酶体室中发现(图2E和F)。F展示了对EEA1或LysoTracker阳性噬菌体聚集的定量分析。
A 部分展示了野生型selz噬菌体和selzHA-TAT工程噬菌体的典型透射电子显微镜（TEM）图像。B 部分展示了在感染 multiplicity of infection (MOI，感染复数) 为0.1、1和10的条件下，SL1344与野生型selz噬菌体和selzHA-TAT工程噬菌体的生长曲线，反映噬菌体对细菌生长的抑制效果及其稳定性。
A、B、C 部分展示了在三种不同的上皮细胞系（Hela、A549 和 Caco-2细胞）中，使用selzHA-TAT噬菌体对细胞内沙门氏菌mCherry-SL1344的杀伤效果。细胞首先被mCherry-SL1344感染12小时，然后用1.5 × 10^9 PFU的噬菌体处理4小时。对照组没有接受噬菌体处理。Y轴表示细胞内mCherry-SL1344的数量。D 部分展示了感染mCherry-SL1344的Hela细胞的平均荧光强度（MFI）。Y轴表示噬菌体处理组与对照组的MFI比值。这些结果表明，selzHA-TAT噬菌体在抑制特定细胞系中细胞内沙门氏菌方面具有潜力。
A、B、C 部分展示了野生型selz噬菌体和selzHA-TAT工程噬菌体对三种不同细胞系（Hela、A549 和 Caco-2细胞）的细胞毒性。噬菌体与细胞共孵化4小时后，测量了细胞内乳酸脱氢酶（LDH）的水平，作为细胞损伤和死亡的指标。细胞毒性分析是通过皮尔斯LDH细胞毒性检测实验进行的。这些结果表明，在实验条件下，selzHA-TAT噬菌体对这些细胞系没有显示出显著的细胞毒性，暗示了其作为治疗剂的潜力。
讨论
讨论部分主要强调了在非模型噬菌体表面成功展示外源肽的可能性，以及通过噬菌体介导的转胞吞作用来穿越上皮细胞层的普遍机制，这可能是人体中噬菌体数量巨大的原因之一。研究指出，噬菌体和细胞穿透肽（CPPs）通过识别细胞表面的不同受体，可能触发不同的内吞作用过程，并在这些过程中可能存在复杂的相互作用。尽管通过体外实验已经证明工程改造的噬菌体selzHA-TAT能够增强噬菌体的细胞内吞作用并有效抑制细胞内的细菌，但为了将其应用于临床治疗，还需要进行更多的体内研究来验证这种方法的有效性和安全性。此外，研究还提到了通过进一步优化策略，例如使用多价CPPs或与pH依赖性膜活性肽融合的CPPs，有可能提高噬菌体的内吞作用和促进噬菌体从内溶体中逃逸，从而更有效地杀死细胞内的细菌。
