高质量蛋白质对人类健康至关重要，但地球上有限的土地、水和其他资源限制了高质量蛋白质的生产。利用合成生物学生产蛋白质已成为蛋白质生产领域新的研究热点。卵清蛋白（OVA）是蛋清中含量最多的成分，约占50%。由于其优异的乳化、发泡和胶凝性能，OVA在食品工业中被用于改善食品的质地和口感。同时，其良好的生物学特性也使其成为有效的药物载体。目前，OVA已经在大肠杆菌、法夫驹形氏酵母、里氏木霉、酿酒酵母等微生物中合成。酿酒酵母因具有良好的遗传背景、广泛的分子生物学工具及不产生内毒素等特点，常被选择作为宿主细胞。
筛选适合OVA分泌的信号肽
真核生物中有两种类型的信号肽。一种是翻译后易位，蛋白质完全翻译到细胞质中，然后易位到内质网。第二种是共译易位，即细胞质中的mRNA被翻译成前端信号肽后，信号肽链被内质网表面的信号识别颗粒识别，肽链在被翻译的同时进入内质网。共译易位信号肽可促进蛋白质的适当折叠，从而提高蛋白质的分泌效率，因此被广泛应用于异源蛋白的分泌表达。作者以酿酒酵母CEN.PK2-1C为底盘细胞，筛选了OST1、INU1、SUC2、MEL1、α-因子和工程α-选择因子，共6种共译易位信号肽。当信号肽为INU1时，OVA滴度为3.4 mg/L。
未折叠蛋白在内质网腔内的过度积累可诱导未折叠蛋白反应（UPR）。内质网中积累的未折叠/错误折叠的蛋白质结合到跨膜蛋白IRE1的结合域，最终触发IRE1的反式自磷酸化和寡聚化。反式自磷酸化和寡聚化IRE1剪接HAC1的前体mRNA。HAC1作为一种转录因子，在其核定位序列的引导下进入细胞核，并通过UPR元件与靶基因结合，从而调节数百个基因的表达。作者将UPR元件序列（PHAC1和PERO1）与报告蛋白mScarlet-I连接并将其整合到基因组中。48 h时，与表达空质粒的菌株相比，表达OVA的菌株荧光值显著增加，UPR被激活1.8倍（PHAC1）和3.5倍（PERO1），表明一定量的错误折叠或未折叠的蛋白质在内质网（ER）中积累。
图1 不同信号肽指导蛋白质分泌的作用
图2 过表达OVA蛋白在ER中激活UPR
伴侣蛋白过表达对OVA 生产的影响
在ER中过表达OVA会导致蛋白质反应未折叠，可能是由于ER的折叠环境不佳以及OVA中存在二硫键。在酿酒酵母内质网腔中，分子伴侣蛋白（如KAR2）和折叠酶（如蛋白二硫异构酶PDI）对蛋白质正常折叠和维持内质网功能至关重要。因此，作者选择了3种不同强度的启动子：PTDH2, PGAP和PPGK1来过表达KAR2和PDI。用PGAP过表达KAR2、PPGK1过表达PDI时（菌株SA1），OVA滴度提高至5.1 mg/L。同时，菌株的生长略有改善。
图3 分子伴侣蛋白过表达和共表达对OVA产生的影响
增大内质网面积对OVA产生的影响
当内质网的UPR被激活时，酿酒酵母除了通过上调促折叠酶和分子伴侣的表达来改善内质网的折叠环境外，还通过调节膜生物合成基因来扩大内质网膜面积。脂质合成途径中许多酶的转录由INO2/INO4异二聚体诱导。INO2/INO4转录因子通过与顺式作用的DNA序列结合来调节靶基因的转录。当脂质合成过多时，OPI1作为负调节因子与INO2结合，以抑制INO2/INO4的形成。作者通过敲除OPI1及用不同强度启动子过表达INO2和INO4来增加OVA蛋白的分泌。结果表明，单独敲除OPI1时（菌株SI1），OVA胞外分泌量约为5.5 mg/L；敲除OPI1、PPGK1过表达INO2及PGAP过表达INO4时（菌株SA2），OVA胞外分泌量约为5.2 mg/L，生长略有下降。48 h时，菌株S1I的UPR强度为0.9 倍（PHAC1型）和0.7 倍（PERO1型）高于对照菌株，而菌株SA2的UPR强度没有显著变化。
为了探讨菌株SA2分泌的OVA是否低于菌株SI1，作者分析了ER大小的变化。Elo3是一种脂肪酸延长酶，已被用作酿酒酵母中ER的标志物。采用mScarlet-I荧光蛋白与Elo3的融合来研究ER膜的扩张。48 h时，与对照菌株相比，菌株SI1和SA2的ER膜膨胀，且菌株SI1的ER膜略大于菌株SA2
图4 增大的内质网膜面积对OVA产生的影响
内质网组合重塑对OVA生成的影响
作者通过结合伴侣蛋白共表达和ER膜扩张来进一步增加OVA蛋白分泌。将PDI和KAR2在菌株SA2中共表达，得到菌株SA4。48 h时，菌株SA4细胞外分泌的OVA增加到6.2 mg/L，较对照菌株提高了82%。
为了验证优化的ER菌株是否促进其他蛋白质的分泌，对mScarlet-I和Ypet进行了异源表达。与对照菌株相比，mScarlet-I的细胞外分泌增加了30%，内源性积累减少了28%。Ypet的细胞外分泌增加了83%，细胞内积累减少了25%。以上结果表明，优化的ER菌株在蛋白质表达方面的多功能性。
图5 内质网组合重塑对重组蛋白产生的影响
3 L生物反应器分批补料发酵生产OVA
为了进一步提高工程酿酒酵母的OVA产量，进行了基因组多拷贝整合（OVA在PGAL1启动子下表达，并选择信号肽INU1）。此外，敲除GAL1、GAL7和GAL10以防止半乳糖降解。随后，通过补充营养不良标记构建菌株SA5。在3 L生物反应器中进行补料分批发酵，72 h时，OVA的产量达到 116.3 mg/L。
图6 菌株SA5在3 L生物反应器中补料分批发酵
原文链接：
https://doi.org/10.1021/acs.jafc.4c05789
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摘译 | 谭新佳
编辑 | 王咏桐
左莎莎
陈嘉序
审核 | 刘 娟
