港科大曾超华团队和内华达大学Eakalak Khan ES&T：利用生物炭调节厌氧发酵过程微生物合成还原力将废氮升级为氨基酸

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近日，香港科技大学曾超华团队与内华达大学Eakalak Khan在环境领域著名学术期刊《Environmental Science & Technology》上发表了题为“Waste Nitrogen Upcycling to Amino Acids during Anaerobic Fermentation on Biochar: An Active Strategy for Regulating Metabolic Reducing Power”的研究论文。文中创新性地提出了一种将废弃物中的铵氮资源升级转化为氨基酸的厌氧发酵新范式。研究团队制备了高温生物炭（BC800；以废弃木质素为基质，热解温度为800℃，热解气氛为N₂），并通过生物炭结构表征、生物炭-生物膜菌体富集，以及宏基因组学和宏蛋白组学追踪生物炭-生物膜菌体的活动，发现高温生物炭的得电子位点对发酵菌产生氧化应激，诱导微生物还原力通量（NADPH，烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸）溢流，刺激戊糖磷酸途径和莽草酸代谢的上调，有利于芳香氨基酸的合成。同时，高温生物炭引起的氧化应激导致微生物蛋白池的更新，非芳香蛋白自溶，而具有芳香氨基酸或其前体合成能力的Escherichia coli在这一过程中成为优势菌。高温生物炭的投加和回收有助于解除氨基酸合成过程中的反馈抑制。高温生物炭表面的芳香结构通过π-π电子作用，驱动芳香氨基酸的固着以及以芳香氨基酸为核心的其他氨基酸自组装过程。与传统厌氧发酵过程及低温生物炭投加的厌氧发酵过程相比，BC800的投加使铵氮转化为氨基酸氮的转化率分别提升了46.8%、199.6%和12.5倍。BC800的生物膜中芳香氨基酸的比例高达70.8%，有望成为一种具有高附加值的植物生长刺激素产品，为减少化肥生产中对化石燃料的依赖做出贡献。

施肥策略与人类社会面临的两个主要挑战密切相关：食品安全和气候变化。畜禽粪便和化学氮肥的生产和使用预计占全球温室气体排放的约5%。为应对这些挑战，利用可被植物和微生物直接利用的氨基酸（AAs）及其衍生的植物生物刺激素（PBs）成为一种有前景的策略。PBs在微量水平上对作物生长具有显著影响，减少对化肥的依赖。特别是，芳香氨基酸（如色氨酸、苯丙氨酸和酪氨酸）是自然界中大多数植物生长素和化感物质的前体。从污水污泥等人类活动排放的废弃物中回收铵氮，并将其转化为氨基酸及其衍生的PBs，可以促进可持续农业，并减缓因生物活性氮排放所造成的气候变化。

氨基酸的微生物合成相较于其他化学制备方法具有多项优势。微生物合成的氨基酸是具有生物活性的L型氨基酸，而化学法不可避免地生成一部分具有生物毒性的D型氨基酸。相比与好氧发酵产氨基酸，厌氧发酵可以降低曝气成本，但目前厌氧发酵产氨基酸鲜有人关注。一项有启发的研究是，在纤维素的厌氧发酵中，还原力NADPH（烟酰胺腺嘌呤二核苷磷酸）的溢流可引发高达60%的铵氮转化为胞外氨基酸。

调节厌氧发酵中的微生物合成还原力流是促进氨基酸生物合成的关键。NADPH（还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸）主要用于合成代谢，而NADH（还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸）则用于分解代谢。研究表明，NADPH的溢出可以推动氨基酸的产生。我们假设，通过生物炭（BC）诱导的氧化应激可以上调NADPH的生成，从而增强氨基酸的生物合成。

本研究使用在400°C、600°C和800℃下热解产生的生物炭（BC），分析可溶相和BC相关生物膜相中的氨基酸组成。对于性能研究，我们比较了有无BC投加的半连续厌氧发酵系统的宏基因组特征。对于机制研究，我们设计了厌氧发酵连续循环反应，以监测功能细菌在BC上的定植活动及其对氨基酸生物合成和生物膜形成的影响。预期结果将为氨基酸生产潜力、BC在调节还原力分配中的机制及其在生物膜中固定氨基酸的作用提供新见解。基于这些发现，可以提出一种有效调节厌氧发酵中微生物合成还原力的技术策略，以实现基于BC的氨基酸的高效回收。

图文导读

图1. 在半连续厌氧发酵（AF）中，20种氨基酸在可溶相（自由态和可溶肽/蛋白中的缩合态）与固定相（即生物炭-生物膜）中的分布，以及NH₄⁺-N输入转化为生物膜中氨基酸氮（BAAs-N）的转化率（A）；在序批厌氧发酵中的氨基酸分布，Cycle1视为生物炭-生物膜（BB）准备阶段，Cycle1的BB被分离并回用作为Cycle2和Cycle 3的接种体（B）；宏基因组学：Cycle 3，BC-AF vs. C-AF的氨基酸代谢差异分析（C）；蛋白质组学：BC-AF vs. C-AF，负责谷氨酸和17种可检测氨基酸合成酶（以10为底的对数）变化倍数（D）。

生物炭添加对氨基酸生产与固定化的改善。本研究分别使用BC400、BC600和BC800处理长时间半连续厌氧发酵（AF）和短期AF循环。在长时间半连续AF实验中，使用了不同热解温度生产的生物炭，分别为SBC400-AF、SBC600-AF和SBC800-AF，同时进行了不添加生物炭的对照实验（SC-AF）。

图1A展示了生物炭对氨基酸生产的积极影响，表现为BC800 > BC600 > BC400。在20天的操作结束时，SBC-AF的总氨基酸生产显著提高（SBC800-AF: 7710 μmol L⁻¹，SBC600-AF: 7700 μmol L⁻¹，SBC400-AF: 4310 μmol L⁻¹），而SC-AF为401 μmol L⁻¹。在氨基酸分布方面，SBC800-AF中生物膜（BB）内的氨基酸占总氨基酸的70.3%，而可溶肽/蛋白中占17.9%，游离氨基酸占11.8%。相比之下，SBC400-AF和SBC600-AF中游离氨基酸、可溶肽/蛋白和BB中的分布分别为7.2-8.2%、43.4-45.6%和46.1-49.5%。因此，BC800和BC600在提高总氨基酸生产方面表现相似，但BC800在生物膜中固定氨基酸的能力更强。此外，在BC800-AF中，芳香氨基酸在BB中的浓度高达70.8%，而SBC600-AF和SBC400-AF分别为38.8%和30.5%。

与空白厌氧发酵（含生物炭但无接种体）和对照厌氧发酵（有接种体但无生物炭，C-AF）相比，BC对氨基酸生产和固定化的正面影响进一步得到确认（BC800-AF > BC600-AF > BC400-AF，图1B）。BC和接种体对氨基酸生产和固定化均不可或缺，其相互作用为关键。循环1至3中，BC800添加引起的芳香氨基酸在BB中的分布分别高达75.8%、84.3%和91.0%，显著高于BC600（20.7%、65.0%、66.4%）和BC400（16.3%、27.4%、24.6%）。此外，在半连续AF中，NH₄⁺-N转化为生物膜中氨基酸氮（BAAs-N）的转化率分别达到22.5%、45.9%和67.4%。

宏基因组和宏蛋白组揭示生物炭调控氨基酸代谢。宏基因组和蛋白质组数据（图1C和图1D）显示，在循环3中，BC-AF反应器的香豆素途径基因（氨基酸前体）和组氨酸生物合成基因的表达显著高于C-AF。蛋白质组分析也表明，BC-AF反应器中铵的同化（通过谷氨酸）和17种可检测氨基酸的生物合成增强。综上所述，BC的添加在基因组和蛋白质组水平上均显著上调了氨基酸的生物合成。关于芳香氨基酸的代谢，与C-AF相比，宏基因组结果表明，在BC400-AF中香豆素途径和色氨酸生物合成下调，而在BC600-AF和BC800-AF中则上调（图1C）。根据蛋白质组结果（图1D），BC800-AF中色氨酸和组氨酸合成酶的表达立即上调了7.0和5.1个数量级，主导了循环1中的氨基酸生物合成。BC600-AF表现出类似但不那么显著的趋势。此外，BC800-AF和BC600-AF在循环2和3中提升了其他氨基酸的合成酶表达。相比之下，BC400-AF未显示出对色氨酸和组氨酸的优先合成，且随着循环的增加，大多数氨基酸合成酶的表达下降。

因此，在BC800-AF中，预计芳香氨基酸的预富集（尤其是色氨酸）和非芳香氨基酸的自组装将驱动氨基酸的固定化。值得注意的是，色氨酸和组氨酸对于电活性和信号传递蛋白的功能至关重要，其生物合成过程能耗较高。例如，在大肠杆菌中，合成一分子色氨酸和组氨酸分别需要74.3和38.3个高能磷酸键，分别在氨基酸生物合成中排名第一和第四。

图2. BC-AF与C-AF相比，ATP生成和利用的百分比变化（A和B），以及NADH和NADPH变化（D和E）；主要ATP消耗途径的丰度（C-AF）及其对数变化倍数（C），以及NADPH生成途径的变化倍数（F）（正变化以红色标记，负变化以绿色标记；MULTISPECIES: NADP依赖的甘油醛-3-磷酸脱氢酶的丰度为零，其在BC-AF中的变化倍数是基于BC400-AF的Cycle 1的丰度计算的）。

生物炭调控微生物氨基酸合成所需的还原力和能量分配。氨基酸生物合成不仅需要由高能磷酸键携带的能量（ATP），还需要特定的还原剂，即NADPH。NADPH通常作为合成反应的还原力，而NADH则通常参与分解过程。

生物炭增强NADPH溢流。在BC800-AF中观察到，NADP依赖的磷酸葡萄糖脱氢酶（NADP-PGD）显著上调，成为改善NADPH生成的主要途径。NADP-PGD是将葡萄糖-6-磷酸转化为核糖-5-磷酸的关键酶，为组氨酸和芳香氨基酸的生物合成提供前体。BC600-AF也在每个循环中上调了NADP-PGD，并下调了NADP-GDH和NADP-GAPDH，但效果不如BC800-AF明显。NADP-PGD的上调是BC800在厌氧发酵中增强NADPH生成的主要机制。NADP-PGD与多种细胞过程相关，包括应对氧化应激和维持细胞的氧化还原平衡。此外，BC800诱导的细胞氧化还原状态变化也进一步影响了代谢能量的代谢。

能量代谢对生物炭诱导的细胞氧化应激的响应。ATP利用的变化反映了生物炭修正引发的能量代谢转变。ATP酶相关途径已在图S10中注释，主要贡献的途径展示在图2F中。BC800-AF和BC600-AF中上调的ATP酶主要由热休克存活AAA家族ATP酶ClpK、氧化还原调节ATP酶YchF和第六型分泌系统（T6SS）ATP酶TssH贡献。ClpK的上调可能与生物炭丰富的氧化还原位点有关，改变电化学势，扰动细胞氧化还原平衡。在ClpK上调的背景下，参与蛋白质展开和降解的ATP酶被激活，从而选择性富集更耐降解的蛋白质。芳香氨基酸富集的蛋白质通常具有较强的耐降解性，因此可能在BC800和BC600中富集。

氧还原调节ATP酶YchF和T6SS ATP酶TssH在BC800-AF和BC600-AF的循环2和3中成为主要ATP酶。YchF在BC800-AF中的上升幅度在三个循环中最高。YchF对蛋白质合成负责的核糖体和分子机器的成熟至关重要。因此，在BC800-AF中，蛋白质降解和合成的最高水平同时实现，表明蛋白质组成发生了显著重组。T6SS ATP酶TssH在许多革兰氏阴性细菌中找到，用于通过分解负责分泌的蛋白质进行细菌竞争。因此，T6SS ATP酶TssH在BC800-AF中富集最多，BC600-AF次之，而在BC400-AF中则下调。