结直肠癌（CRC）是最常见的癌症类型之一，也是全球癌症死亡的主要原因。研究报道，微生物代谢物与结直肠癌进展（CRC）密切相关，在CRC患者中富集了促肿瘤的肠道代谢物，包括三甲胺N-氧化物（TMAO）和脱氧胆酸。相反，短链脂肪酸和吲哚衍生物在CRC患者中减少，而已知这些物质具有抗肿瘤功能，并能提高癌症治疗效果。同时，肠道代谢物可被吸收到血液循环中来调节宿主免疫。然而，目前仍不清楚腺瘤-癌序列中粪便和血液代谢组如何变化以及生物学通路机制，需要进一步的详细严谨系统的工作来阐述血液中的代谢物是否会影响CRC的发展以及是否有合适的代谢标志物可以指示结直肠癌早期症状以及表型。结肠镜检查仍然是CRC诊断的标准程序，但其侵入性和高昂的操作成本限制了其大规模筛查的应用。鉴于代谢组学技术的进步，多项研究已表明检测粪便代谢物作为非侵入性诊断在CRC中的可行性，同时目前仍然缺乏对粪便和血液代谢物之间诊断性能比较的研究。
针对以上问题，2024年8月12日，香港中文大学于君教授、昆明医科大学缪应雷教授及南京医科大学沈洪兵院士团队等在《Cancer Cell》（IF=48.80）在线发表研究论文。
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本研究通过大型队列CRC样本全靶向代谢组学和靶向代谢组学多中心队列验证，并表征不同组别样本血浆和粪便代谢组中显著差异的代谢物为油酸和别胆酸，成功构建17个血浆代谢物诊断模型（灵敏度87.0%、特异性97.2%）能够区分CRA患者和早期CRC，系统阐明血浆代谢物可作为CRC患者无创早期诊断生物标志物具有广阔的应用前景。
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图1 本研究工作流程示意图
纳入来自1,251名个体的样本，包括CRC患者、CRA患者和健康对照者，发现队列373份粪便和血浆样本，以及来自三个独立验证队列的878份血浆样本。通过代谢组学分析，团队分别确定了NC（正常对照组）、CRA（结直肠腺瘤组）和CRC（结直肠癌组）的粪便和血浆代谢物特征，特别是油酸富集和别胆酸耗竭。使用 CRC 细胞系、患者来源的类器官（PDO）和小鼠模型证实了这些关键代谢物的作用，并随后对其潜在机制进行了研究。此外，团队比较粪便和血浆代谢物的临床潜力，发现血浆代谢物具有更好的诊断性能。在通过靶向代谢组学和验证队列确认后，团队开发包含 17 种血浆代谢物生物标志物的诊断模型，可准确区分不同阶段的CRC患者。
采用非靶向液相色谱-质谱法（LC-MS）对血浆样本中的代谢物进行鉴定比较分析。去除食物来源和外源性代谢物后，鉴定了1,026种内源性代谢物。分析显示，CRC、CRA和正常对照（NC）组之间的血浆代谢组存在显著差异（均p<0.05；图2A）。揭示了在NC、CRA和CRC之间一致变化的差异血浆代谢物，有22种代谢物含量沿着腺瘤-癌序列逐步增加，包括犬尿氨酸、二氢胸腺嘧啶及多种脂肪酸（如油酸）（图2B和2C）。团队还观察到，在CRA和CRC中，有34种代谢物逐步减少。此外，与非进展期腺瘤患者相比，进展期腺瘤患者的血浆中促肿瘤生成的代谢物明显增加。
除了血浆代谢物之外，在发现队列中还平行收集了373份粪便样本，使用非靶向LC-MS鉴定了1,988种内源性代谢物。由PLS-DA和OPLS-DA分析得出，CRC、CRA和NC组之间的粪便代谢组存在显著差异（均p<0.05；图2D），然后通过成对比较确定了CRC进展各阶段中显著变化的粪便代谢物。揭示了在NC、CRA和CRC之间一致变化的差异粪便代谢物，有4种代谢物沿着腺瘤-癌序列逐步增加（图2E）。团队还观察到，在CRA和CRC中，有28种代谢物逐步减少。此外，与非进展期腺瘤患者相比，进展期腺瘤患者的粪便中，有益的代谢物显著减少。总的来说，团队通过代谢组学分析鉴定了与CRC进展不同阶段相关的标志性血浆和粪便代谢物。![]()
在72例接受化疗的CRC患者中评估了代谢物与治疗反应之间的相关性，其中包括43例反应者和29例无反应者。化疗反应者与非反应者之间的血浆代谢组存在显著差异（p<0.05；图2F）。在反应者中发现了脱氢异雄酮硫酸盐、L-组氨酸和DHEA硫酸盐的富集，以及促肿瘤生成的犬尿氨酸、TMAO和石胆酸甘氨酸缀合物的减少（图2G）。类似地，在化疗反应者与非反应者之间也观察到了显著的粪便代谢组差异（p<0.05），其中反应者中抗肿瘤生成的2-吲哚羧酸和柠康酸增加。此外，在调整临床参数后，一个包含19种血浆代谢物的组合可以从非反应者中区分出化疗反应者，曲线下面积（AUC）为90.8%（敏感度=86.4%，特异性=83.3%）（图2H）。
2. 微生物代谢物在CRC进展各阶段的相关性和功能作用
为了深入了解CRC中改变的代谢物的功能意义，团队进行了代谢物集合的富集分析。在血浆代谢物中，与NC相比，CRC中前三大差异代谢途径是（1）α-亚麻酸和亚油酸代谢，（2）组氨酸代谢，和（3）同型半胱氨酸降解（图3A）。在CRC的粪便代谢组中，前三大差异代谢途径是（1）组氨酸代谢，（2）丙氨酸代谢，和（3）葡萄糖-丙氨酸循环（图3B）。随后评估了CRC与NC相比，改变的代谢物和代谢途径的相关网络。团队的分析表明，CRC血浆（图3C）和粪便（图3D）代谢组中的差异代谢物主要与脂质代谢有关，其中这些脂质代谢物与其他代谢物和代谢途径形成了分离的簇。此外，脂质代谢中的油酸和组氨酸代谢中的L-组氨酸位于相关网络的中心，因此提示了它们在CRC进展期间在血浆和粪便代谢组中的重要性。使用Spearman相关性检验了CRC进展各阶段中配对的血浆和粪便代谢物之间的相关性。团队确定了CRC中血浆和粪便代谢组之间9种显著相关的代谢物（相关系数>0.3，FDR<0.05）（图3E）。团队还注意到，差异的血浆和粪便代谢物几乎没有重叠，并且在CRC与NC相比，血浆和粪便代谢组中多个代谢途径的改变并不一致。这些发现因此提示了CRC进展中血浆和粪便代谢组之间的独特改变。![]()
微生物代谢物与肠道微生物紧密关联，为了描绘肠道微生物群落，团队对发现队列中的粪便样本进行了宏基因组测序。从NC到CRA再到CRC，肠道微生物的α多样性显著降低（图3F）。在物种水平上，与CRC相关的病原体Parvimonas micra、Fusobacterium nucleatum和Peptostreptococcus sp.在NC-腺瘤-癌序列中持续富集，伴随有益的Lachnospiraceae细菌、Roseburia sp.和Faecalibacterium sp.的减少（图3G）。随后检验了CRC中差异代谢物与肠道微生物之间的相关性。团队的分析发现，CRC富集的血浆和粪便代谢物都与CRC富集的微生物呈正相关（图3H）。相反，CRC减少的代谢物与CRC富集的微生物呈负相关。在血浆代谢物中，包括油酸在内的脂肪酸与CRC富集的微生物具有最显著的正相关。另一方面，F. nucleatum与所有CRC富集的血浆代谢物具有显著的正相关（图3H）。在粪便代谢物中，CRC富集的melleolide M与所有CRC减少的微生物呈负相关（图S3D）。考虑到炎症是CRC进展的标志，团队通过对发现队列中的80份血清样本（29例CRC，29例CRA，22例NC）进行细胞因子分析来评估血浆代谢物与细胞因子之间的相关性。团队的分析发现，促炎细胞因子如CXCL10和白介素（IL）-8与CRC富集的代谢物（如犬尿氨酸和油酸）呈正相关，或与CRC减少的代谢物（如异型胆酸和L-组氨酸）呈负相关（图3I）。相比之下，抗炎细胞因子IL-4和IL-13与CRC富集的代谢物呈负相关。
为了验证计算机模拟的结果，团队用最富集的CRC相关代谢物处理了人CRC细胞系（HCT116、HT29和DLD-1），这些代谢物包括油酸和二氢胸腺嘧啶（图2C）。油酸（50 μM）显著促进了CRC细胞的存活率（图4A），并减少了细胞凋亡（图4B）。它还导致CRC细胞在合成（S）期的数量显著增加，同时G1期的细胞数量相应减少（图4C）。此外，油酸处理后，CRC细胞的增殖能力显著增强（图4D）。团队进一步用油酸培养了CRC类器官（patient-derived organoids, PDOs），并在处理后观察到了类器官生长的增加（p < 0.05；图4E）。对于二氢胸腺嘧啶，虽然它也促进了CRC细胞的生长和存活，但其促肿瘤形成的效果不如油酸显著。
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同样的体外生物功能实验用于检测最减少的CRC相关代谢物对人CRC细胞的影响，这些代谢物包括异型胆酸和L-组氨酸（图2C）。异型胆酸（500 μM）显著降低了细胞存活率（图4F），并在CRC细胞中促进了细胞凋亡（图4G）。它还在CRC细胞中诱导了细胞周期停滞（图4H），并显著限制了细胞增殖（图4I）。此外，异型胆酸显著抑制了CRC类器官的生长（p < 0.0001；图4J）。同时，L-组氨酸也表现出强烈的抗肿瘤效应，对CRC细胞的生长和存活产生了影响，但其效果不如异型胆酸显著。4. 关键功能代谢物在小鼠CRC致瘤性中的功能验证
团队使用化学致癌物偶氮甲烷（AOM）加硫酸葡聚糖钠（DSS）建立了一个CRC致瘤性小鼠模型，并通过口服给予这些小鼠CRC富集的油酸或载体对照（图5A）。在内窥镜下，与对照组小鼠相比，接受油酸处理的小鼠观察到了较大的结肠肿瘤。经过6周的处理后，小鼠被处死，团队发现油酸显著增加了结肠肿瘤的大小和肿瘤负荷（两者p < 0.05；图5B）。组织学评估证实了小鼠中结肠肿瘤的发生（图5C），并且油酸处理显著增加了增殖细胞的比例（p < 0.05；图5D）。
团队也给AOM/DSS诱导的CRC小鼠模型补充了CRC减少的异型胆酸（图5E）。在AOM/DSS处理的小鼠中，异型胆酸处理组在内窥镜下观察到的结肠肿瘤较少。在处死后，与对照组相比，异型胆酸处理的小鼠表现出显著较小的肿瘤尺寸（p < 0.05）和肿瘤负荷（p < 0.001）（图5F）。异型胆酸处理也显著降低了增殖细胞的比例（p < 0.001；图5G和5H）。为了确认上述发现，团队建立了转基因ApcMin/+ CRC致瘤性模型，并给这些小鼠补充异型胆酸（图5I）。在内窥镜下，接受异型胆酸处理的小鼠观察到较少的结肠肿瘤。与AOM/DSS处理的小鼠结果一致，异型胆酸显著降低了ApcMin/+小鼠的肿瘤大小（p < 0.001）和肿瘤负荷（p < 0.05）（图5J）。组织学检查证实了结肠肿瘤的发生（图5K），并且异型胆酸处理降低了增殖细胞的比例（p < 0.0001；图5L）。综合来看，团队从两个CRC致瘤性模型的一致发现展示了促肿瘤生成的油酸和抗肿瘤生成的异型胆酸及L-组氨酸在CRC进展中的影响。
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图5 CRC小鼠模型中关键代谢产物的功能验证
5. 血浆代谢物在CRC诊断中的表现优于粪便代谢物
团队研究了代谢物作为CRC和CRA诊断生物标志物的应用，利用鉴定出的差异血浆代谢物，团队构建了多种机器学习（LASSO和随机森林）和逻辑回归模型来分类CRC和非癌症（NC）个体。在调整了年龄、性别、体质指数（BMI）和肿瘤位置等临床参数后，一个由17种血浆代谢物生物标志物组成的Panel在区分CRC与NC方面表现出优异性能，通过LASSO得到的曲线下面积（AUC）为0.927（灵敏度=80.2%，特异性=93.6%）（图8A）。这些发现共同表明血浆代谢物作为CRC诊断生物标志物比粪便代谢物更准确。
团队评估了团队17种血浆代谢物生物标志物在区分不同CRC阶段方面的性能。该Panel区分早期CRC（I/II期）与NC的AUC为0.958（灵敏度=89.5%，特异性=90.9%）（图8A）。它在区分CRC与CRA方面的性能也很出色，AUC为0.928（灵敏度=89.0%，特异性=88.7%）。然后团队将该Panel的性能与CRC的临床诊断标志物（如粪便免疫化学试验[FIT]和几种血清标志物[如癌胚抗原[CEA]，神经元特异性烯醇化酶[NSE]，碳水化合物抗原[CA]-19-9]）进行了比较。结果表明，血浆代谢物生物标志物在区分CRC与NC方面比FIT（AUC=0.796，p<0.001）或血清标志物（AUC=0.521至0.794，p<0.001）具有显著更好的性能。这些发现表明血浆代谢物作为早期检测CRC的生物标志物具有较好的性能，优于临床标志物。![]()
图6 血浆代谢物组作为不同CRC分期的诊断生物标志物团队建立了一个独立的验证队列（验证队列1，n=321），以验证团队17种血浆代谢物的性能（图1）。该Panel区分CRC与NC的AUC为0.987（灵敏度=99.1%，特异性=88.4%），区分早期CRC（I/II期）与NC的AUC为0.988（灵敏度=96.3%，特异性=92.0%）（图8B）。团队在另一个独立的验证队列（验证队列2，n=281）中测试了团队17种血浆代谢物的性能。如预期的那样，该Panel在验证队列2中区分CRC与NC的性能很好，AUC为0.848（灵敏度=78.5%，特异性=81.3%），区分早期CRC（I/II期）与NC的AUC为0.860（灵敏度=81.5%，特异性=78.5%）（图8C）。为确保地域差异不会影响结果，团队从一个独立区域建立了验证队列（验证队列3，n=276），以评估团队17种血浆代谢物的性能。该Panel区分CRC与NC的AUC为0.909（灵敏度=84.5%，特异性=88.8%），区分早期CRC（I/II期）与NC的AUC为0.920（灵敏度=94.0%，特异性=80.0%）（图8D）。团队进一步评估了团队17种血浆代谢物在发现队列和三个验证队列中作为CRA诊断的性能。该Panel区分CRA与NC的AUC为0.968（灵敏度=87.0%，特异性=97.2%）（图S8A）。在验证队列1中，其区分CRA与NC的AUC为0.955（灵敏度=98.2%，特异性=77.7%），在验证队列2中AUC为0.838（灵敏度=85.0%，特异性=69.2%），在验证队列3中AUC为0.725（灵敏度=65.5%，特异性=69.8%）。总之，这些发现证实了团队17种血浆代谢物生物标志物在CRA诊断中的潜在价值。
1. 本研究通过大型队列多中心对CRC进展样本进行全靶向和靶向代谢组学筛查验证分析，发现血浆和粪便代谢组中显著差异的代谢物通过油酸富集、别胆酸的耗尽发挥生物学代谢功能并通过体外功能实验确认关键代谢物在小鼠CRC致瘤性中的机制以及功能。![]()
2. 在临床上，团队建立的血浆代谢物诊断模型能够区分CRA患者和早期CRC，并通过靶向代谢组学和三个独立验证队列进行确认。综上所述，本研究发现代谢物在CRC进展中的关键作用以及血浆代谢物作为CRC患者无创早期诊断生物标志物的广阔应用前景。Driving innovation for better life！
