PCR，全称聚合酶链式反应，是一种用于在体外特异性扩增DNA片段的重要分子生物学技术。PCR的反应过程主要包括预变性、变性、退火、延伸和完全延伸等步骤。简单来说，PCR的原理是通过高温使模板DNA解开双螺旋结构，然后与特异性引物的碱基序列互补结合，进而在体外进行DNA的扩增复制。PCR技术在生物医学领域具有广泛的应用，能够快速、准确地复制目标DNA片段，为基因检测、疾病诊断和生物研究提供了重要的技术支持。
PCR试验是一种常用的分子生物学技术，在实验中所需的试剂包括ddH2O、引物、DNA模板、DNA聚合酶、dNTPs和缓冲液。引物作为PCR实验的重要组成部分，在设计引物时有几个关键点需要注意：
①引物的长度，一般建议将PCR引物长度控制在约20个碱基左右。
②引物的Tm值，上下游引物的Tm值应该相近，通常保持在55℃左右。
③引物中GC含量的比例，应保持在40-60%之间。
一、PCR电泳无扩增条带
1.原因：
①.酶失活或未加入酶到反应体系中
②.模板含有杂质
③.变性温度设定不准确
④.反应系统中受到蛋白酶和核酸酶的污染
⑤.引物变质失效
⑥.引物错误
⑦.进行DNA凝胶电泳时加入阳性对照，以确保问题不是源自DNA凝胶或PCR程序本身。
2.问题解答
①.更换新酶或使用其他来源的酶来获得满意的PCR结果；
②.针对甲醛固定和石蜡包埋的组织，要特别留意可能存在的甲酸杂质，导致DNA脱嘌呤从而影响PCR结果；
③.确认PCR仪的温度设定与实际温度是否相符，过高的温度会导致酶在前几个循环内迅速失活，过低则会导致模板变性不充分；
④.在检测到蛋白酶和核酸酶污染时，在加入Taq酶之前，对反应体系进行95°C加热5-10分钟；
⑤.检查人工合成的引物是否正确，并确认其是否纯化或可能因储存条件不当而失活；
⑥.使用BLAST技术来验证引物的特异性或重新设计引物。
二、PCR产量过少
1.原因：
①.退火温度不正确设置
②.使用的DNA模板量过少
③.PCR循环数不足
④.引物量不足
⑤.延伸时间太短
⑥.变性时间过长
⑦.DNA模板中存在抑制剂
2.问题解答
①.设计梯度PCR反应以2度为梯度进行，优化退火温度
②.增加DNA模板量
③.增加反应循环数
④.增加引物在反应体系中的浓度
⑤.根据1kb/分钟的原则设置适当的延伸时间
⑥.避免变性时间过长导致DNA聚合酶失活
⑦.确保DNA模板干净
三、PCR产物弥散，拖尾或偏斜
1.原因
①.酶量过高
②.dNTP浓度过高
③.MgCl2浓度过高
④.模板量过多
⑤.引物浓度不够优化
⑥.循环次数过多
⑦.退火温度过低
⑧.电泳体系问题：凝胶中缓冲液和电泳缓冲液浓度差异过大、凝胶固化不完全、琼脂糖质量不佳；
⑨.若使用PCR试剂盒可能由于运输储存不当导致试剂盒失效，也可能是试剂盒本身质量问题，例如引物选择不当、循环参数设置错误等；陈旧模板的扩增也容易产生涂布现象。
⑩.降解的陈旧模板扩增也易产生涂布
2.问题解答
①.减少酶量；如酶质量不佳，可尝试更换其他来源的酶
②.减少dNTP的浓度
③.可适当降低MgCl2
④.控制合适的模板量，质粒DNA应使用<50ng，基因组DNA则应使用<200ng；⑤.对引物进行梯度稀释，重复PCR反应；
⑥.增加模板量，减少循环次数至30次，减少退火及延伸时间，或尝试使用两种温度的PCR循环。
四、非特异性扩增
1.原因
①主要原因包括引物与靶序列不完全互补或引物聚合形成二聚体
②Mg2+离子浓度过高、退火温度过低以及PCR循环次数过多等因素
③是酶的质和量,往往一些来源的酶易出现非特异条带而另一来源的酶则不出现,酶量过多有时也会出现非特异性扩增。
2.问题解答
①必要时重新设计引物，确保引物与靶序列完全互补
②减少酶的使用量或考虑使用另一种来源的酶
③降低引物的浓度，适当增加模板的量，并减少PCR循环次数
④.适当提高退火温度，或采用二温度点法（93℃变性，65℃左右退火与延伸）。
五、扩增产物出现多余带（杂带）
原因
1.引物使用量偏大导致缺乏特异性。
2.PCR循环次数过多。
3.酶的使用量过高或酶质量不佳。
4.退火温度设置过低。
5.样品处理不当
6.Mg2+浓度偏高
7.若使用PCR试剂盒，可能试剂盒本身存在质量问题。
8.复制提前终止
9.反应缓冲液未完全融化或未充分混匀
10.引物特异性差
11.引物量过多
12.模板量过多
13.外源DNA污染
问题解答
1.应调换引物或降低引物的使用量
2.适当增加模板的量,减少循环次数
3.应降低酶量或调换另一来源的酶
4.应提高退火温度,减少变性与延伸时间,也可采用二种温度的PCR扩增。以2度为梯度设计梯度PCR反应优化退火温度。
5.因适当调整Mg2+使用浓度
6.使用非热启动的聚合酶时常有发生。冰上准备反应体系或采用热启动聚合酶
7.确保反应缓冲液融化完全并彻底混匀
8.利用BLAST检查引物特异性或重新设计引物
9.减少反应体系中引物的用量
10.质粒DNA的用量应<50ng,而基因组DNA则应<200ng
11.确保操作的洁净
六、PCR时出现交明显引物二聚体
1.原因
PCR反应中出现引物二聚体现象的原因可能是由于DNA聚合酶作用下，一条引物在另一条引物序列上进行延伸，形成与引物长度相近的双链DNA片段，这是PCR常见的副产物之一，有时甚至可能成为主要产物。
①引物之间或者自身存在互补序列
②模板量过低
③引物浓度过大
④退火时间过长
2.问题解答
①重新设计引物
②若模板浓度过低，可适当增加模板量；
③降低退火温度后出现条带后，应逐渐提高温度，若随着温度升高，产物量减少，考虑增加镁离子浓度，根据扩增片段长度的不同决定镁离子的浓度；
④若降低退火温度后仍然只出现引物二聚体，而且在20-25mmol/L浓度下镁离子没有差异，可以考虑试剂Buffer等没有完全混合溶解，导致吸取的试剂浓度不准确。
七、PCR假阳性
1.原因
①.选择的扩增序列与非目的扩增序列具有同源性，则会导致扩增出的PCR产物为非目的性的序列，这可能是由于靶序列过短或引物过短引起的。
②.序列或扩增产物之间的交叉污染也会导致PCR假阳性结果的出现。
2.问题解答
①.首先需要重新设计引物，确保引物与目标序列的特异性。②.在操作过程中，务必小心轻柔，避免发生内部或溅出的情况，以防止将靶序列吸入加样枪。此外，为了防止交叉污染，应避免将除酶及不能耐高温的物质带入反应体系中。所有试剂或器材均应严格按照高压消毒的标准进行处理，离心管和样品进样枪等应一次性使用，以确保实验的准确性和可靠性。
免责声明：本号对所有原创、转载文章陈述与观点均保持中立，内容仅供读者学习和交流。文章、图片等版权归原作者享有，如有侵权，请留言联系更正或删除。
随着国自然竞争的日益激烈，如何让自己的申报项目脱颖而出，成为了科研工作者的一大难题。今天，我们带来了《2025国自然申报技巧解密系列课程》，助你在申报路上一臂之力。
本系列课程结合最新的国自然政策动向和丰富的实战经验，为你提供全方位的申报指导。从国自然项目的发展历程到申报与评审流程，从立项依据的撰写到研究团队的配置，每一环节都配有精辟的讲解和实用的技巧。
2025国自然申报技巧解密系列课程
【亮点1】全面解析国自然的前世今生
掌握从科学假说到研究方案的撰写方法，让你的标书结构清晰、逻辑严谨，打动评审专家！
你知道为什么有些标书会被淘汰？是因为立项依据不充分？还是团队配置不合理？课程揭秘申报中那些不为人知的关键因素，教你如何避坑，让标书顺利通过审核。
立即扫码，开启你的国自然申报成功之旅！
