兰兽研：非洲猪瘟病毒 RNA 聚合酶亚基 C315R 和 H359L 激活 PKR-eIF2a 通路抑制宿主翻译并抑制炎症反应

非洲猪瘟（ASF）是一种对家猪、野猪和疣猪等具有高度传染性和致命性的出血性疾病，其致死率可达100%。自2018年非洲猪瘟病毒（ASFV）基因II型毒株传入中国以来，给中国的养猪产业带来了毁灭性的经济损失，并迅速蔓延至全国，严重影响了大规模生猪生产。尽管目前已有关于ASFV的研究，但对其复制、转录和翻译过程中的病毒蛋白功能知之甚少，这限制了我们对ASFV复制过程的体外理解及其体内毒力的理解，也阻碍了有效抗病毒治疗的发展。

在这项研究中，研究人员分析了非洲猪瘟病毒(ASFV)中pC315R和pH359L氨基酸序列在相同基因型的不同分离株间的保守性。通过对比10个基因型中的36个分离株的序列，发现pC315R和pH359L在基因型I和II中的相似性超过了99%，表明这两个基因在这些基因型中高度保守。特别地，在基因型II的分离株中，pC315R和pH359L的氨基酸序列一致性达到了100%。这一发现强调了ASFV某些基因序列的高度保守性，并揭示了不同基因型间复杂的系统发育关系，为未来ASFV多样性和进化的研究提供了重要见解。

图1.ASFV-C315R和H359L的生物学特性

2.C315R和H359L基因表达丰度在急性感染ASFV的死猪脾脏中最高

研究结果表明，C315R和H359L基因在感染非洲猪瘟病毒（ASFV）后死亡的猪体内表达量最高的器官是脾脏。通过对急性感染ASFV的死亡猪的血液、心脏、肝脏、脾脏、肺、肾脏和淋巴结等不同组织样本进行qPCR分析，研究人员发现C315R基因的DNA拷贝数与CP204L基因相似，其中在脾脏中的表达量最高，其次是肾脏、淋巴结、肺和血液，而在肝脏和心脏中的表达量相对较低，特别是在肝脏中的表达量最低。与CP204L和B646L基因相比，H359L基因在血液和各种组织（心脏、肝脏、脾脏、肺、肾脏和淋巴结）中的DNA拷贝数表现出类似的模式，其中心脏中的表达量最低。这些发现表明C315R和H359L在ASFV感染的病理过程中可能起着关键作用，并且脾脏可能是病毒复制和抗原呈递的重要场所。

图2.通过 qPCR 检测 ASFV 感染猪的不同组织中的 ASFV-C315R、-H359L、-CP204L 和-B646L 基因

3.C315R 和 H359L 基因在 ASFV 复制过程中早期转录，编码早期 (C315R) 和中间蛋白 (H359L)

在这项研究中，C315R和H359L基因在非洲猪瘟病毒（ASFV）复制过程中被早期转录，分别编码早期和中期蛋白。通过在ASFV感染的猪肺泡巨噬细胞（PAM）中进行不同时间点的样本采集和分析，研究人员发现C315R和H359L的mRNA水平从感染后2小时（hpi）开始就能被检测到，并在整个研究期间保持一致，与早期转录控制基因CP204L的模式一致。而晚期控制基因B646L的转录则从16 hpi开始，表明其在病毒复制的后期发挥作用。此外，通过使用DNA复制抑制剂AraC进行的实验表明，C315R和H359L蛋白的表达水平不受影响，表明它们的表达早于病毒DNA复制。这些结果证实了C315R和H359L在ASFV复制周期中分别作为早期和中期蛋白的角色，并且对病毒的复制和转录起着至关重要的作用。

图3.ASFV-C315R 和 H359L 基因转录和表达动态

4.pC315R 和 pH359L 是 ASFV 感染的重要蛋白质，可促进 ASFV 在 PAM 和 MA104 细胞中的复制

研究显示，pC315R和pH359L蛋白对非洲猪瘟病毒（ASFV）的感染至关重要，并在猪肺泡巨噬细胞（PAM）和非洲绿猴肾上皮细胞（MA104）两种细胞系中促进了ASFV的复制。通过在MA104细胞中转染带有ASFV C315R或H359L基因的质粒，随后用ASFV进行感染，结果显示过表达C315R或H359L显著增强了病毒滴度，并以剂量依赖性方式提高了病毒CP204L（p30）和B646L（p72）的mRNA和蛋白水平。此外，通过siRNA技术敲低C315R或H359L表达后，PAM细胞中ASFV的复制效率显著降低，这表明C315R和H359L基因对ASFV的复制至关重要。这些发现强调了C315R和H359L在ASFV感染周期中的作用，并为开发针对ASFV的抗病毒策略提供了潜在的靶点。

图4.ASFV pC315R 和 pH359L 的过度表达可促进病毒复制和子代产生

图5.ASFV C315R 和 H359L 的下调会破坏 ASFV DNA 复制和子代产生

5.ASFV-C315R和H359L表达对细胞增殖的影响

通过将HA-C315R或HA-H359L质粒转染到PK15、3D4/21、MA104和HEK293T细胞中，并使用CCK-8试剂盒来评估细胞活力，研究发现过表达C315R或H359L的细胞与对照组相比，细胞活力显著下降，并且这种下降是以剂量依赖性的方式发生的。这表明C315R和H359L蛋白可能对细胞活力产生负面影响，暗示了它们在ASFV感染过程中可能抑制宿主细胞的增殖，从而为病毒复制提供优势。

6.C315R 和 H359L 对 PKR 和 eIF2α 磷酸化状态和 SG 组装的影响

评估非洲猪瘟病毒(ASFV)的RNA聚合酶亚基C315R和H359L对PKR (蛋白激酶R)和eIF2α (真核翻译启动因子2α)的磷酸化状态以及应激颗粒(SG)组装的影响。结果显示，当C315R和H359L被过表达时，依赖于PKR/eIF2α通路的激活，它们可以诱导宿主翻译关闭，并抑制宿主的抗病毒反应。此外，C315R和H359L能够防止eIF2α非依赖性的应激颗粒形成，并且过表达ASFV C315R或H359L显著降低了大多数细胞因子的表达，从而抑制了宿主的炎症反应。这表明ASFV利用这些蛋白来调节宿主的翻译机制和细胞应激反应，以促进病毒复制。

图6.C315R 和 H359L 对 PKR 和 eIF2α 磷酸化状态和 SG 组装的影响

7.病毒蛋白 C315R 和 H359L 抑制 3D4/21 细胞中的细胞因子产生

研究表明，非洲猪瘟病毒(ASFV)的C315R和H359L蛋白在3D4/21细胞中能够抑制细胞因子的产生。具体来说，过表达这些蛋白时，大多数促炎细胞因子的表达水平显著降低，包括TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8和IFN-β。然而，与C315R相比，H359L过表达时，IL-12和IL-18的表达增加，而IL-10和IL-4 mRNA水平上升。特别是，IL-18在许多病毒感染中起保护作用，它被H359L而不是C315R特异性上调。此外，抗炎细胞因子IL-10和IL-4在H359L表达细胞中上调，而在C315R表达细胞中下调。这些发现揭示了ASFV蛋白如何可能调节宿主的炎症反应，从而有助于病毒逃避宿主的免疫防御。

图7.C315R 或 H359L 的过度表达会诱导 3D4/21 中较低的炎症细胞因子产生

研究深入探讨了非洲猪瘟病毒(ASFV)中两个关键RNA聚合酶亚基C315R和H359L的功能和作用机制。研究发现，这两个基因在ASFV基因型II毒株中高度保守，并且在病毒复制和转录中发挥重要作用。C315R和H359L通过激活PKR-eIF2α通路来抑制宿主翻译，同时抑制炎症反应，从而在ASFV的复制过程中起关键作用。

研究结果揭示了C315R和H359L在ASFV感染的早期和中期转录，并且它们的蛋白表达延迟。通过免疫荧光和西方印迹分析，证实这两种蛋白主要定位于宿主细胞的细胞质和核中。此外，过表达实验表明，C315R和H359L能够显著增加病毒滴度、RNA转录水平和病毒蛋白表达水平，而使用siRNA敲低这些基因则减少了病毒的复制效率。

ASFV C315R 和 H359L 通过激活 PERK/PKR-eIF2a 通路抑制宿主翻译并抑制炎症反应的示意图

最后，本研究还发现C315R和H359L在调节宿主细胞的PKR和eIF2α磷酸化状态以及应激颗粒形成中发挥作用，并且能够抑制促炎细胞因子的产生。这些发现为理解ASFV如何在宿主细胞内复制提供了新的见解，并可能有助于开发新的针对ASFV的抗病毒策略。

doi: 10.3389/fmicb.2024.1469166

校对：Collin

投稿合作：shouyiyanquan@163.com