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作者：杨建花 何小宁 刘治 王文哲 李蓓
通信作者：李蓓
作者单位：第四军医大学口腔医院口腔组织病理学教研室 口颌系统重建与再生全国重点实验室 国家口腔疾病临床医学研究中心 陕西省口腔疾病国际联合研究中心（杨建花、何小宁、王文哲、李蓓）；第四军医大学口腔医院口腔正畸科 口颌系统重建与再生全国重点实验室 国家口腔疾病临床医学研究中心 陕西省口腔疾病临床医学研究中心（刘治）
引用本文：杨建花, 何小宁, 刘治, 等. 甲氨蝶呤载药囊泡在小鼠实验性牙周炎治疗中的作用研究[J]. 中华口腔医学杂志, 2024, 59(7): 681-689. DOI: 10.3760/cma.j.cn112144-20231114-00249.
目的
探究甲氨蝶呤载药囊泡对小鼠实验性牙周炎的治疗作用。
方法
分离人脐带间充质干细胞（hUC-MSC）的细胞外囊泡（EVs）。构建甲氨蝶呤（MTX）载药囊泡（MTX-EVs）并通过扫描电镜及动态光散射仪（DLS）对构建的载药囊泡进行形态大小分析，通过蛋白质印迹法对其表面特异性蛋白进行鉴定。选取4~5周C57BL/6J雄性小鼠40只，通过盲抓法随机抽取其中8只不做处理，正常饲养作为对照组（由第四军医大学实验动物中心提供），其余小鼠利用脂多糖（LPS）（2 g/L，5 μl）牙周局部注射诱导小鼠牙周炎模型，间隔1天注射1次，诱导2周。将成功诱导牙周炎模型小鼠通过盲抓法随机分为4组，每组8只。分别为LPS组、LPS+MTX组、LPS+EVs组及LPS+MTX-EVs组。牙周局部治疗2周后，酶联免疫吸附测定（ELISA）检测牙龈组织炎症因子白细胞介素（IL）-1β、IL-6及肿瘤坏死因子α（TNF-α）的质量浓度。通过显微CT（micro-CT）、HE染色评估对照组、LPS组、LPS+MTX组、LPS+EVs组及LPS+MTX-EVs组小鼠的牙槽骨吸收情况。流式细胞仪分析牙龈组织中γ干扰素（IFN-γ）阳性细胞的占比。
结果
扫描电镜结果显示EVs和MTX-EVs呈圆形或椭圆形，DLS粒径分析证明EVs粒径在200 nm左右，MTX-EVs粒径在300 nm左右。ELISA结果显示，对照组、LPS组、LPS+MTX组、LPS+EVs组及LPS+MTX-EVs组IL-1β质量浓度分别为（28.86±2.76）、（51.50±2.04）、（35.26±2.40）、（45.49±2.04）、（35.77±3.49）ng/L；LPS+MTX组、LPS+EVs组及LPS+MTX-EVs组IL-1β质量浓度均显著低于LPS组（均P<0.05）；LPS+MTX-EVs组IL-1β质量浓度显著低于LPS+EVs组（P<0.05）。对照组、LPS组、LPS+MTX组、LPS+EVs组及LPS+MTX-EVs组IL-6质量浓度分别为（125.44±4.12）、（221.64±10.59）、（178.16±16.90）、（181.09±18.22）、（170.15±9.04）ng/L；LPS+MTX组、LPS+EVs组及LPS+MTX-EVs组IL-6质量浓度均显著低于LPS组（均P<0.05）；LPS+MTX-EVs组IL-6质量浓度显著低于LPS+EVs组和LPS+MTX组（均P<0.05）。对照组、LPS组、LPS+MTX组、LPS+EVs组及LPS+MTX-EVs组TNF-α质量浓度分别为（320.27±38.68）、（479.62±40.94）、（342.18±25.89）、（415.88±12.01）、（325.75±30.83）ng/L；LPS+MTX组、LPS+EVs组及LPS+MTX-EVs组TNF-α质量浓度均显著低于LPS组（均P<0.05）；LPS+MTX-EVs组TNF-α质量浓度显著低于LPS+EVs组及LPS+MTX组（均P<0.05）。micro-CT扫描结果显示，对照组、LPS组、LPS+MTX组、LPS+EVs组及LPS+MTX-EVs组小鼠右上颌第一磨牙第一牙根处釉质牙骨质界到牙槽嵴顶的距离分别为（0.11±0.03）、（0.28±0.02）、（0.23±0.03）、（0.20±0.04）、（0.18±0.03）mm，与LPS组相比，LPS+MTX组、LPS+EVs组及LPS+MTX-EVs组骨吸收均得到不同程度的抑制，差异均有统计学意义（均P<0.05），其中LPS+MTX-EVs组与LPS+MTX组及LPS+EVs组相比，骨吸收抑制效果最好，且差异均有统计学意义（均P<0.05）。流式细胞仪检测结果显示，LPS组、LPS+EVs组及LPS+MTX-EVs组IFN-γ阳性细胞占比分别为（11.77±1.02）%、（6.87±0.65）%及（4.15±0.92）%，LPS+EVs组及LPS+MTX-EVs组中IFN-γ阳性细胞占比均显著低于LPS组（均P<0.05），LPS+MTX-EVs组中IFN-γ阳性细胞占比显著低于LPS+EVs组（P<0.05）。
结论
MTX-EVs可有效改善牙周炎模型小鼠牙周局部炎症环境，减少小鼠牙槽骨骨吸收。
牙周炎是由菌斑微生物引起的慢性感染性疾病，以牙周组织的慢性破坏为主 ［ 1 , 2 ］ 。第四次全国口腔健康流行病学调查报告显示，87%~97%的中国成年人患有不同程度的牙周疾病 ［ 3 , 4 ］ 。目前，针对牙周炎的治疗方法是常规抗感染治疗，例如牙周洁治或牙根清创术。但这些基础治疗通常只能达到清洁刮治牙周表面的作用，无法完全清除病原微生物入侵牙周组织引起的感染和炎症 ［ 5 , 6 ］ 。因此，有效缓解牙周炎症进而减少牙槽骨吸收成为亟待解决的问题。
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（参考文献略）
