近期，斯隆—凯特林癌症研究所、康奈尔大学威尔医学院等联合研究小组通过利用CosMx单细胞空间原位分子成像技术对1360例胰腺癌患者进行了检测分析，绘制了胰腺导管腺癌（PDAC）单细胞空间转录组图谱，探讨了早期（I期）与晚期（II-III期）PDAC的临床和病理特征，重现并详细分析了不同等位基因的特异性差异，特别是KRAS基因不同突变体与早期疾病和临床结局的关系。发现含有且高表达KRASG12R突变型与预后改善密切相关，强调了突变特异性在PDAC中的重要性。
该研究成果于2024年9月9日发表在《Cancer Cell》杂志上。
McIntyre CA, Grimont A, Park J. et al. Distinct clinical outcomes and biological features of specific KRAS mutants in human pancreatic cancer. Cancer Cell. 2024 Aug 22:S1535-6108(24)00296-4.
doi: 10.1016/j.ccell.2024.08.002.
研究概览
胰腺导管腺癌（PDAC）是一种预后极差的恶性肿瘤。大多数患者在诊断时已经处于局部晚期或已发生转移，只有大约20%的患者能在诊断时进行手术切除治疗。KRAS基因突变在PDAC中非常常见，且不同的KRAS突变型可能在肿瘤的恶性程度上有所不同，但这种差异对患者的影响尚未得到深入研究。
该研究中，研究人员利用CosMx空间单细胞多组学等方法，对1360例PDAC患者样本进行了检测研究，发现与KRASG12D相比，KRASG12R肿瘤的结节和远处复发率降低，生存率提高。KRASG12R突变主要集中在早期（I 期）胰腺癌，这并不是因为该阶段肿瘤较小，而是因为结节阴性增加。
为了了解其分子生物学基础，研究人员利用CosMx单细胞空间原位分子成像技术对20名个体（14例肿瘤患者和6例正常个体）样本进行了单细胞分辨率的空间转录组和空间蛋白分析，结合100个肿瘤组织块样本的RNA-Seq数据，分析发现KRASG12D肿瘤的致癌信号转导和上皮-间质转化 (EMT) 增强，而KRASG12R肿瘤细胞核因子NF-kB信号转导增强。
这些发现也在小鼠模型中得到了验证。总之，该项研究发现并证实了PDAC中不同的KRAS突变亚型与不同的表型、临床结果和生物学反应有关，突显了突变分析的预后价值以及阐明突变特异性的分子生物学机制的重要性。
主要发现
早期PDAC中KRASG12R突变更为常见，这些患者淋巴结节较少，远处复发减少，总体生存率提高；
CosMx单细胞空间转录组分析显示，KRASG12R肿瘤中致癌信号减少，而KRASG12D肿瘤中致癌信号和上皮-间质转化 (EMT) 增加；
使用小鼠KrasG12R PDAC类器官进行的研究表明，这些类器官在体外迁移能力降低，并且在同种移植模型中存活率提高。
CosMx单细胞空间转录组分析确定了KRASG12R和 KRASG12D PDAC之间等位基因特异性的差异
为了了解不同突变亚型所导致不同临床结果的分子生物学基础，研究人员对来自20名个体（6名正常个体、7名KRASG12R PDAC患者和7名KRASG12D PDAC患者）的40个胰腺组织样本（组合成两个组织芯片）进行了单细胞空间原位分子成像（400个FOV）。
研究队列：20名个体，包括6名正常个体、7名名KRASG12R PDAC患者和7名KRASG12D PDAC患者。
检测方案：CosMx™ Universal Cell Characterization RNA Panel (1000-plex RNA) 和CosMx™ Human Immuno-Oncology Protein Panel (67-plex 蛋白)。
PDAC患者样本显示出非常复杂的微环境和样本间的异质性。细胞分型分析发现，KRASG12D和KRASG12R肿瘤的细胞组成高度相似，脱落细胞和免疫浸润程度相似，且与正常组织明显不同。
研究人员接下来利用CosMx技术进行了空间邻域分析，以确定样本中的Niche细胞社群。分析发现，KRASG12D和KRASG12R具有不同的细胞社群特征，KRASG12D样本中Niche 3和Niche 8的丰度增加。对KRASG12D样本Niche 3进行细胞组成分析发现其中富含T细胞（60%），Niche 8也有类似的特征（T细胞占比95%），但基本没有肿瘤细胞，而KRASG12R样本的Niche 2中的T细胞和肿瘤细胞都非常丰富，这表明不同的KRAS突变肿瘤与免疫系统的交界不同。
接下来，研究人员又检测了KRASG12R和KRASG12D肿瘤的蛋白标记物丰度，观察到KRASG12R中的细胞角蛋白、NF-kB(p65)和CD31表达富集，但EMT标记物（波形蛋白和纤维连接蛋白）和免疫细胞标记物却表达很少，这突出了KRASG12D和KRASG12R肿瘤的分子和空间差异。
图 6. PDAC的空间分子图谱显示KRASG12D和KRASG12R的等位基因特异性差异。A. CosMx单细胞空间原位分子成像技术的工作流程示意图；B. 蛋白质靶标空间定位的成像示例；C. 14例代表性PDAC患者组织切片的细胞分型结果；D和E. 按细胞类(D)或KRAS等位基因(E)对13名患者进行细胞分型后的UMAP；F. 所有正常、KRASG12D和KRASG12R样本中所示细胞类型的丰度；G. 鉴定出的不同样本中的细胞社群示例；H. 所有正常、KRASG12D和KRASG12R样本中细胞社群丰度；I. 每种突变型（KRASG12D或KRASG12R）的每个视场（FOV）中属于Niche 3的细胞比例；J.不同细胞社群中每种细胞类型的丰度；K. 正常、KRASG12D和 KRASG12R样本蛋白表达丰度差异。
KRASG12R在人类PDAC样本和小鼠模型中显示出减弱的恶性特征
利用CosMx单细胞空间原位分析成像技术对KRASG12R患者的深入分析揭示了PDAC独特的复发模式，即向远处器官扩散的趋势减弱。此外，研究人员还发现包括CDKN2A在内的肿瘤抑制因子的共突变率增加。在基因表达方面，KRASG12R在PDAC中显示出减弱的KRAS信号转导、EMT和增殖转录程序，这些发现在KRASG12R和KRASG12D肿瘤的空间分子图谱分析中得到了验证。
研究人员还观察到，在肿瘤组织区域中，KRASG12D表现出纤维连接蛋白和波形蛋白等间质标记物的表达富集，而KRASG12R则显示出炎症信号的增加，这些发现与先前的观察结果一致，即在“去增生性”肿瘤中表现出KRASG12D的富集，而没有KRASG12R。总之，这些数据支持临床前的研究结果，即KRASG12R是一种“较弱”的致癌突变，在小鼠模型中生成肿瘤的能力以及激活PI3K信号和巨胞饮的能力都较弱，而这两种能力都是PDAC的关键特征。研究人员通过同源KRASG12D p53KO和KRASG12R p53KO PDAC器官组织进一步验证了这些生物学观察结果。
基于这些发现，研究人员推测KRASG12R突变体代表了一种生物学上独特的“路径”，除了KRASG12D或 KRASG12V之外，它还需要更多的肿瘤抑制因子失活，以克服其信号传导缺陷，实现恶性进展。此外，KRASG12R突变肿瘤似乎也代表了一种独特的终点：虽然组织形态学与KRASG12D无异，但转录差异持续存在，微环境发生改变，扩散能力受损。
图 7. KRASG12R在人和小鼠PDAC中显示出减弱的恶性特征。
结论和讨论
这项研究为理解KRAS基因不同突变体在PDAC中的作用提供了新的见解，并对开发针对特定KRAS突变的新型治疗策略提供了帮助。该研究中，CosMx技术的应用为解析胰腺癌的分子异质性和微环境特征提供了新的视角，有助于更好地理解肿瘤的生物学行为，并为未来的治疗研究提供了重要的信息。
迄今为止，对可切除PDAC的治疗在很大程度上仍与KRAS状态无关，也没有关于切除前进行分子图谱分析的共识建议。然而，该研究结果表明，KRASG12R患者的远处复发可能性较低，因此切除术（即局部控制）的获益应该更大。该项研究提出这些都是临床上需要立即考虑的问题，并且强调了突变亚型分析的重要性，因为它对生存和复发部位有影响，而且不同基因型的肿瘤之间存在生物学差异。
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