BT丨英国帝国理工学院Rodrigo Ledesma-Amaro团队合成海洋光驱动的自养-异养共培养系统用于可持续β-香叶烯生产

生物生产是化石燃料衍生产品的一个有前景的替代方案。然而，由于与传统工艺相比生产成本较高，生物生产往往效率不高。降低生物生产成本的一种方法是使用低成本的碳源。在这方面，光养生物由于能够利用光和二氧化碳作为碳和能量来源，相比异养生物具有优势。自养和异养微生物的共培养有潜力结合自养生物（利用二氧化碳和光）和异养生物（更高效的遗传工程和生产产量）的优势。这些共培养通过劳动分工，一个固定二氧化碳，另一个将从二氧化碳衍生的碳分子转化为最终产品。本研究旨在创建一个基于海洋蓝藻Synechococcus sp.PCC 7002 (Syn7002)的合成海洋光驱动联合体。作为异养配对，选择了工业酵母 Yarrowia lipolytica，因其高效的遗传工程工具、生产多种分子的能力、在多种环境中的强大生长能力及其他优势。在设计的共培养系统中，工程化的Syn7002可以利用二氧化碳、光和微量营养物质生长，并为Y. lipolytica提供蔗糖，而Y. lipolytica可以将其转化为增值代谢产物。作为概念验证，评估了β-香叶烯的生产，β-香叶烯在制药、化妆品和燃料工业中具有广泛应用。

工程化海洋蓝藻Syn7002以分泌蔗糖

第一个目标是工程化海洋蓝藻Syn7002以生产蔗糖，作为共培养中合作物种的碳源。来自大肠杆菌的cscB基因因其在蔗糖分泌中的作用而被选择，并在同义密码子优化后异源表达于Syn7002。两个本地基因spsA（蔗糖磷酸合成酶）和sppA（蔗糖磷酸磷酸酶）被过表达，以增强细胞内蔗糖的积累。此外，作者异源表达了Synechocystis sp. PCC 6803 (Syn6803)中蔗糖生产至关重要的ugp（UDP-葡萄糖焦磷酸化酶）基因。基因的表达受clac143启动子的控制，且表达盒整合到中性位点(NSI)中。随后，为了增加蔗糖的积累，作者删除了amsA基因，该基因编码淀粉蔗糖酶，将蔗糖转化为葡萄糖和果糖。工程化菌株分别在两种不同的培养基AD7和改良的AD7 (MAD，含有更高的NaNO₃含量)中培养，以评估蔗糖的生产。表达cscB基因的菌株(RLAS1010)在发酵14天后分泌了约0.6 g/L的蔗糖。RLAS1014菌株在asmA基因敲除背景下，额外携带过表达spsA、sppA和ugp的表达盒，蔗糖浓度进一步提高，在AD7培养基中达到2.6 g/L。在MAD培养基中培养尽管表现出更高的生物量，但蔗糖产量较低，仅为1.8 g/L。与MAD培养基相比，AD7中的较低氮水平似乎导致了更高的蔗糖生产，这与之前在蓝藻中研究氮限制或缺乏条件的研究结果一致。因此，AD7培养基被选择用于后续实验。

图1 用于蔗糖积累和分泌的海洋蓝藻的构建

优化工程蓝藻分泌蔗糖的培养条件

已知在盐胁迫下，蔗糖在蓝藻中作为渗透保护剂发挥作用。因此，可以通过增加渗透压来调节蔗糖的生产和分泌。作者评估了不同NaCl浓度对工程化菌株RLAS1014的生长和蔗糖产量的影响。有趣的是，RLAS1014 即使在没有NaCl补充的情况下也能排出蔗糖，在IPTG诱导24天后达到了0.8 g/L。确定最佳的NaCl浓度为100 mM，随后在后续实验中使用。在此条件下，IPTG诱导后8、16和24天培养基中的蔗糖浓度分别达到了0.6 g/L、1.7 g/L和3.6 g/L。虽然先前的研究报告指出，淡水蓝藻在静止生长阶段具有显著的蔗糖生产，但本研究显示，海洋蓝藻的蔗糖积累是在指数生长阶段开始的，且积累速率与细胞密度呈正相关。为了提高蔗糖积累的效率，作者研究了初始细胞密度对蔗糖产量的影响。较高的初始细胞密度显著加速了培养基中蔗糖的积累。在前八天中，初始OD₇₃₀值为2、4、6和8的不同培养的蔗糖积累平均速率分别为70、90、110和120 mg/L/d。初始OD₇₃₀值为6和8的培养在接下来的16天中蔗糖生产速率保持相对稳定。另一方面，初始OD₇₃₀值为2和4的培养显示出上升趋势，分别从诱导前的170 mg/L/d上升到诱导后的240 mg/L/d。值得注意的是，在诱导24天后，四种不同初始细胞浓度条件下的蔗糖积累似乎相似。这些结果表明，初始细胞密度主要影响蔗糖积累的初始速率，而对最终的总蔗糖生产可能没有显著影响。此外，作者还评估了初始OD730对RLAS1014生长的影响。IPTG诱导对蓝藻生长有轻微抑制作用。增加初始细胞密度似乎是提高蔗糖分泌速率的可行策略。然而，需要注意的是，增加初始细胞密度也加速了细胞进入静止生长阶段。这解释了为什么初始OD730值为8的菌株在16天后OD730值下降，而初始OD730值较低的菌株仍处于对数生长阶段。通过对生长曲线和蔗糖生产曲线的综合分析，选择初始OD730值为6进行后续实验。

图2 工程化的Syn7002菌株(RLAS1014)单培养条件对蔗糖分泌的影响

构建能够从蔗糖中

生产β-香叶烯的Yarrowia lipolytica菌株

Yarrowia lipolytica以其积累高水平脂质的能力而闻名，这归因于其丰富的乙酰辅酶A (acetyl-CoA)储备。作者选择 β-香叶烯作为概念验证产品。作者采用了从黄花蒿(Artemisia annua)中获得的β-香叶烯合酶基因(QHS)和来自酿酒酵母的HMG-CoA还原酶基因(HMG)进行工程化，以催化萜烯合成中的速率限制步骤，并在强启动子PTEF下表达。所有实验中使用的母株Po1d已经被工程化以利用蔗糖。因此，在PTEF启动子下过表达了ScSUC2。通过结合这两种策略，成功构建了一个工程化的Y. lipolytica菌株(RLAS2873)，能够从20 g/L的蔗糖或葡萄糖作为碳源中生产约28 mg/L的β-香叶烯。此外，RLAS2873菌株在蔗糖上的生长没有表现出母株Po1d中观察到的延长滞后期，表明该菌株在蔗糖消耗上工程成功。

在考虑优化共培养系统的培养条件时，需要考虑多个因素。其中两个重要因素是氮源和微量元素。因此，作者评估了在AD7培养基中补充不同营养物质对RLAS2873生长的影响。评估的策略如下：不进行额外补充（作为对照）、补充1.7 g/L不含氨基酸和硫酸铵的酵母氮源基础（YNB，作为微量元素）、5 g/L氯化铵（NH4Cl）或同时补充YNB和氯化铵（YN）。AD7培养基中存在的含氮化合物，如硝酸钠、维生素B12和乙二胺四乙酸钠（Na2EDTA），不足以支持RLAS2873的生长。观察到同时添加YNB和NH4Cl（YN）时，RLAS2873的生长最好，因此选择该配方（AD7+YN）进行后续实验。此外，作者还比较了原始菌株Po1d和RLAS2873在两种不同培养基（AD7+YN+G 和AD7+YN+S）中的生长情况。与YNBG和YNBS中的趋势类似，（i）RLAS2873在AD7+YN+G和AD7+YN+S培养基中的生长曲线几乎相同；（ii）在葡萄糖培养基中（YNBG或AD7+YN+G），RLAS2873的生长速度较慢，这可能与基因表达负担有关。RLAS2873菌株在培养24小时后完全将20 g/L蔗糖分解为葡萄糖和果糖，培养结束时剩余约2 g/L果糖。然后，作者在选定的培养基AD7 + YN + S中评估了初始蔗糖浓度与β-香叶烯产量之间的关系。观察到随着蔗糖浓度从2.5 g/L增加到10 g/L，β-香叶烯的产量逐渐增加，这表明蔗糖浓度是影响β-香叶烯产量的重要因素。此外，作者还研究了NaCl浓度这一影响蓝藻生长和蔗糖生产的关键因素。结果表明，Y. lipolytica在AD7+YN+培养基中对100至308 mM的不同NaCl浓度具有很高的耐受性，这与之前的研究报告一致。尽管随着NaCl浓度的降低，β-香叶烯的产量略有增加，但这种影响并不显著。此外，AD7+YN+培养基在β-香叶烯的生产上比MAD+YN+培养基稍微有优势。因此，在接下来的共培养实验中选择了含100 mM NaCl的AD7培养基。

图3 Y. lipolytica的工程改造

用于从蔗糖中生产β-香叶烯

建立海洋蓝藻

与Y. lipolytica的共生合成群落

在共培养的生物合成中，优化接种比例往往被证明是重要的。因此作者评估了不同的Y. lipolytica接种比例对β-香叶烯生产的影响。作者测试了蓝藻的其中一种发酵培养基（OD730 = 13.8，收获时蔗糖浓度为0.9 g/L）。将不同初始光密度(OD)范围为0.1至0.8的Y. lipolytica接种到该培养基中。随着初始OD的增加，β-香叶烯的产量从0.2 mg/L逐渐增加至2.4 mg/L。因此，选择OD600为0.8的接种量用于共培养中的Y. lipolytica。接下来，作者在共培养中优化了其他培养参数。不同的IPTG诱导时间（0、8、16、24天）导致了不同的最终OD730值（分别为6、13.8、21.0和23.8）和蔗糖浓度（分别为0、0.9、2.6和4.0 g/L）。在这些不同的时间点开始共培养导致在两个不同的实验设置中产生了不同的β-香叶烯产量。在顺序培养中，使用蓝藻过滤的培养基接种Y. lipolytica，而在共培养中，则是将Y. lipolytica直接添加到蓝藻培养基中。两个条件下测试了诱导时间和YN补充等因素。在顺序培养中，未添加YN补充剂时获得了4.3 mg/L的β-香叶烯，而添加YN补充剂时则获得了8.6 mg/L。在共培养中，未添加YN补充剂时，β-香叶烯的产量提高了1.8倍。同样，添加YN补充剂的共培养中显示出略高的产量。研究表明，额外的氮源对于Y. lipolytica在基于AD7的共培养中生产β-香叶烯至关重要。此外，观察到初始蔗糖浓度与β-香叶烯产量之间存在线性关系，无论是在共培养还是顺序培养中，这表明初始蔗糖浓度在共培养性能中的重要性。

图4 建立蓝藻与Y. lipolytica的共生系统

蓝藻与Y. lipolytica的共生系统的优化

鉴于营养补充剂在β-香叶烯生产中的重要性，作者评估了在最佳条件下（IPTG诱导24天）添加酵母提取物和肽（YP：10 g/L酵母提取物和20 g/L肽）对共培养和顺序培养的影响。值得注意的是，在添加YP补充剂后，通过共培养获得了最高的β-香叶烯产量，达到了14.1 mg/L，比顺序培养的产量高出31%。在共培养6天后，发酵液的颜色从绿色变为白色，这与没有氮源补充的其他发酵液明显不同。这种变化表明，YP进一步支持了Y. lipolytica的生长，导致酵母生物量和β-香叶烯产量在顺序培养和共培养中均有所增加。然而，需要注意的是，YP是一种未定义的复杂培养基补充剂，可能还含有蔗糖或其他碳源，这可能会影响Y. lipolytica的生长和β-香叶烯的生产。

图5 YP和YN补充对β-香叶烯生产的影响