摘要:癌症是全球死亡的原因之一。其成因包括生理、化学和有机毒素。癌、白血病、肉瘤和中枢神经系统（CNS）癌症是特定类型的癌症，它们在特定器官（良性）或全身（恶性）无控制地生长。由于癌症的恶性特性和对治疗的抵抗性，成功治疗癌症仍然是一个挑战。传统的治疗方式，如放射疗法、化疗和免疫疗法在一定程度上控制癌症有局限性。因此，利用微生物基因已成为癌症治疗中一个有前景的方法。
19世纪首次确认使用微生物基因治疗癌症。包括酶基疗法、细菌素、细菌孢子和细菌毒素（B.T.）在内的多种方法，都是利用微生物作为疫苗治疗癌症。在癌症治疗中使用梭状芽孢杆菌、沙门氏菌和李斯特菌的基因。虽然微生物基因不能完全治愈癌症，但它们的高度特异性、复制能力和肿瘤对微生物的易感性提供了更成功地防止疾病在全球范围内传播的手段。然而，使用微生物对抗癌症也存在某些局限性，如高反应性、不可控感染和有限的治疗范围。癌症研究将继续进行，直到找到成功的治疗方式。
1.癌症简介
癌症是一种广泛的疾病类别，身体的任何部位都可能受到影响，当一些生物体细胞无控制地发展并迁移到其他身体区域时就会发生。如图6.1所示，异常细胞的快速发展超出了它们的正常范围，随后可能感染其他身体部位并扩散到其他器官。最终，这些异常细胞会形成肿块或肿瘤。这些肿瘤可能是癌症性的或良性的。恶性肿瘤可以通过称为转移的过程扩散到各个区域形成新的肿瘤，并侵入身体的邻近组织。非癌症肿瘤不侵犯或扩散邻近组织。恶性肿瘤在切除后可能会重新生长，但良性肿瘤通常不会。受导致癌症的遗传变化影响的三种主要基因类型是原癌基因、肿瘤抑制基因和DNA修复基因。这些变化被认为是癌症的“驱动因素”。
图 6.1 癌细胞生长的表示。
1.1.恶性肿瘤的四个阶段
第一阶段：没有肿瘤进展到淋巴结或其他组织，局限于一个小部位。
第二阶段：肿瘤已经生长但未广泛扩散。
第三阶段：肿瘤增大并可能侵入淋巴结和其他组织。
第四阶段：肿瘤已经转移到身体远端部位。也称为转移性或晚期癌症。
1.2.肿瘤成因
生理毒素，如紫外线和电磁辐射，合成毒素如酒精、石棉、烟草、吸烟、食品掺假物和砷（污染饮用水），以及有机毒素如特定微生物，如病毒、细菌或寄生虫，都可能导致其发展。
1.3.癌症的特定类型
1.癌：一种恶性肿瘤，通常起源于上皮细胞或围绕内脏器官的细胞群。癌有以下子类别：移行细胞癌、基底细胞癌、皮肤鳞状细胞癌和腺癌。
2.肉瘤：一种癌症，始于软组织或支持性细胞群，如软骨细胞、脂肪、肌肉骨骼系统或血管。
3.白血病：一种白血细胞的恶性肿瘤，起源于产生血细胞的骨髓。
4.非霍奇金淋巴瘤和骨髓瘤（卡勒病）：这些是从免疫系统细胞开始的恶性肿瘤。
5.中枢神经系统癌症：影响大脑和脊髓的解剖和生理的癌症。癌症仍然是全球死亡的首要原因。在2018年，报告了960万死亡和1810万新病例。预计到2030年将有1700万人死亡。这些数字强调了开发新有效疗法的紧迫性。传统的癌症治疗方法，如手术、放射、化疗和免疫疗法，都有其局限性。由于癌症的复杂性，包括测量、位置、阶段和恶性的问题，治疗多个肿瘤可能具有挑战性。此外，常常会产生抗性，导致放射、化疗和免疫疗法的效力降低，导致癌症控制不佳和治疗期间或治疗后的各种不良反应。已经提出了额外的治疗方法，如细胞疗法、饮食疗法、激光疗法、胰岛素调节疗法、HAMLET、端粒酶疗法、热疗法、二氯醋酸和非侵入性射频治疗癌症，以增强和提高传统癌症治疗的有效性。
2.癌症疫苗（CV）
疫苗是一种活性产品，能够提供针对特定感染或恶性肿瘤的主动获得性免疫。疫苗接种通常涉及给予微生物的弱化或灭活形式、其毒素或其表面蛋白之一。这刺激了身体的免疫系统将物质识别为威胁，消除它，然后在后续接触到相同物质时识别并消除它。疫苗可以是预防性的，减少由自然或“野生”病毒引起的即将发生的疾病的迹象和症状，或者是治疗性的，针对已经发展的疾病，如癌症。一些疫苗提供完全的灭菌免疫。
CV旨在引发身体免疫系统对肿瘤抗原的免疫反应。尽管经过数十年的研究和发展，只有少数CV被批准用于人类使用，同时还有更多正在接受不同阶段的临床测试。这些CV的有效性取决于诸如抗原和毒素类型、肿瘤微环境（TME）、肿瘤的防御机制和疫苗配方等因素。如图6.2所示，免疫后肿瘤抗原被运送到淋巴系统，在那里它们刺激特定的淋巴细胞（T和B淋巴细胞）识别抗原。B淋巴细胞直接识别抗原，而T淋巴细胞则通过树突状细胞（DC）激活，这些细胞在主要组织相容性复合体（MHC）分子上呈现疫苗抗原。激活的B淋巴细胞和有效的T淋巴细胞产生抗体（Abs），这些抗体穿透肿瘤并诱导肿瘤细胞死亡。
图 6.2 癌症疫苗的表示。
3.基于微生物基因的癌症治疗
全球癌症相关死亡率的增加，需要开发有效的措施来控制这一威胁。实体瘤的病理生理学对进入和在体内积累抗肿瘤化疗药物施加了严格的限制。尽管传统的化疗药物仍然常用，但由于其高度特异性、执行后可控性和在许多生物体上的肿瘤效果，细菌疗法已经显示出令人印象深刻的结果。然而，在临床实践中使用细菌作为抗肿瘤剂仍然存在几个问题。基因是染色体上DNA片段上的基本遗传单位。遗传修饰的微生物将越来越多地用于诊断和治疗目的。可以修改并利用微生物的内在特性。迄今为止，已经探索了微生物作为癌症治疗选择的各种应用。潜在的方法包括使用活的、弱化的微生物作为抗癌剂和基因控制的酶前药治疗载体。肿瘤靶向细菌是针对癌症的治疗有效载荷的卓越递送系统，这得益于它们的肿瘤选择性和无限的基因包装能力。这种无限的基因包装能力使得表达大型或多个目标基因成为可能，有助于构建信号网络，使细菌能够在癌症治疗中执行复杂任务。随着遗传工程的进步，药物现在可以增强分子如细胞因子、药物代谢酶、肿瘤触发剂、坏死受体，甚至RNA干预，以提供改进的治疗效果。这些药物的临床试验已经显示出有希望的结果。作为传统癌症治疗的替代品，现在已经开始了实验，探索微生物作为主要或补充治疗的潜力。图6.3描述了基于微生物基因治疗的历史。
图 6.3 基于微生物基因治疗的历史表示 。
在各自的研究中，德国医生Wilhelm Busch和Friedrich Fehleisen发现，一些肿瘤在无意中感染由化脓性链球菌引起的表层蜂窝织炎、丹毒后缩小，这种情况发生在患者住院期间。独立地，美国医生William Coley观察到他的一位颈部癌症患者在感染丹毒后开始好转。这位患者感染了细菌。他启动了使用细菌及其抗原治疗晚期癌症的首次广泛记录的实践。在19世纪末，他开发了一种危险性较小的疫苗，使用两种死亡的细菌种类，吲哚血清杆菌和化脓性链球菌，来模拟疾病及其相关的发热，而没有真正的感染风险。此外，该疫苗成功地用于治疗各种肿瘤，包括肉瘤、癌、淋巴系统癌症、黑色素瘤和骨髓瘤。
Coley毒素活性背后的机制一直是癌症研究者的兴趣所在。免疫学和生物技术的最新进展重新点燃了这一兴趣。通过遗传工程，已经开发出许多可以专门针对肿瘤并表现出各种抗癌效果的减毒细菌。这项技术被称为细菌介导的癌症治疗（BMCT），最近受到了关注。现代医疗技术允许检查多种细菌种类，包括链球菌、双歧杆菌、梭状芽孢杆菌和沙门氏菌。
针对肿瘤的活的、弱化的或遗传改变的细菌种类具有固有的定植和渗透肿瘤的能力。它们可以在肿瘤内特异性地繁殖，防止恶性细胞的形成。
在动物肿瘤模型上进行的研究表明，活癌症靶向细菌可以有选择地定植肿瘤或癌性淋巴结，抑制肿瘤生长，并在系统感染后增加存活时间。例如，最著名的弱化沙门氏菌VNP20009菌株，其肿瘤与肝脏定植比例大于1000:1，比野生型菌株弱化超过10,000倍。它还显示出在模型上对肿瘤生长的强烈抑制效果。肿瘤靶向细菌可以增强化疗药物的效果，同时最小化对患者的系统伤害，并克服渗透障碍。
4.细菌递送的不同方法
4.1.作为抗癌疫苗的遗传改造细菌
基因治疗是传统癌症治疗的一种创新替代方法。基因治疗的主要优势在于其能够选择性地靶向并消灭肿瘤细胞。遗传改良的细菌在对抗肿瘤方面可能更有效，对宿主的致病性也更低。最近的研究中，使用生物基因改造的细菌来展示抗癌药物以及肿瘤特异性抗原，以开发癌症治疗的新方法。表6.1描述了不同的微生物及其作为抗癌剂使用的治疗策略。在恶性肿瘤中，观察到遗传改造的细菌与正常组织相比，繁殖更为显著。使用携带特定治疗基因的生物基因改造微生物是克服这些限制的一种策略。这些微生物载体可以作为某些癌症治疗的有效辅助治疗，通过选择性地在肿瘤微环境中产生所需的蛋白质。因此，细菌作为载体或运输工具，将治疗蛋白质、前药转化酶、细胞毒素肽或抗癌药物输送到实体肿瘤。借助这样的系统，体内药物制造可以在时间和位置上进行控制。以这种方式调节基因表达的方法主要分为三类：内部触发、自我触发（群体感应-QS）和外部触发。
可以修改特定抗原的处理以增强免疫反应。例如，已经显示产生连接到细胞内运输位点的融合蛋白的基因序列可以增强和优化抗原呈递。Salmonellas er.VNP20009和C.butyM55被用作动物肿瘤模型中的代理，以诱导肿瘤的特定定植，从而产生强烈的防御反应和危险的次级反应。然而，这些研究结果中的一些并没有产生预期的结果。尽管如此，仍然可以通过遗传工程C. ace和C. bei菌株来表达特定微生物酶的基因，如胞嘧啶脱氨酶（CD）、硝基还原酶或m-TNF，从而产生更有利的抗癌效果。一些研究表明，细菌可以产生与HIF1结合的免疫球蛋白。临床研究表明，改造的S. typhi和Clostridium novyi NT，表达HlyE或Stx2（一个酸性pH响应启动子）或recA（一个38 kDa的蛋白质，对DNA维护和修复至关重要），可以刺激宿主防御系统产生细胞因子IL2、IL4、IL18和CC 21，最终导致肿瘤退缩和终止。将细菌疗法与放疗、化疗、免疫疗法或其他形式的癌症治疗结合起来可能是一种创新而有效的策略。原位疫苗接种（ISV）是另一种癌症预防方法。疫苗使用佐剂和抗原来刺激免疫系统，但确定癌症的确切抗原已被证明是具有挑战性的。ISV涉及将佐剂直接注入肿瘤，将其作为抗原的来源。主要目标是诱导强烈的局部抗肿瘤反应，逆转局部肿瘤介导的免疫抑制，随后将这种反应传播到全身，以对抗已知或疑似的转移性疾病。
4.2.酶前药（非活性药物）治疗
基于癌症的选择性释放非活性药物是规避细菌疗法不利副作用的卓越方法。在这项技术中，使用厌氧细菌递送一种酶，该酶可以将无害的前药转化为致命的前药。递送专门针对肿瘤区域，细菌在坏死和缺氧区域繁衍。为了增强效果，非活性和活性药物都必须能够穿过细胞膜，因为非活性药物在微生物中被激活，然后活性药物进入癌细胞之前。这是因为非活性药物只在肿瘤区域内被转化为活性和有害药物。已经使用C. sporogenes进行了测试，使用酶NR，将非活性药物CB1954转化为DNA交叉耦合剂，以及CD，将无毒的5FC转化为抗癌药物5FU。然而，尽管这些组合能够在体外消灭癌细胞并向恶性肿瘤输送大量酶，但迄今为止体内结果不佳。使用在醋酸丁酸梭菌中开发的CD，将外源酶精确地递送到肿瘤中。这种载体系统对癌症基因治疗很有价值，因为大多数人类实体肿瘤包含缺氧和坏死区域。细菌酶精氨酸脱氨酸-I的分子量大约为46 kDa。这种酶通过切割和转化精氨酸来代谢氨基酸，最终导致氨的释放。当与聚乙二醇（PEG）聚合物结合时，精氨酸脱氨酸被称为ADI-PEG20。它通过触发自噬，限制肿瘤细胞的生长和繁殖，并诱导非caspase依赖性凋亡，具有抗癌影响。因此，精氨酸脱氨酸已被用作抗癌药物，目前正在进行第二阶段的临床试验。这种酶显示出作为癌症治疗的有前途的潜力，适用于多种恶性细胞系，包括肝癌细胞系。
4.3.细菌毒素（B.T.）
为了执行特定任务，细菌会发展并释放一组称为B.T.的高度有毒蛋白质。这些毒素已被证明是治疗肿瘤的有效策略。B.T.能够破坏细胞，或者在较低浓度下干扰调节分化、细胞死亡和增殖的细胞过程。这些干扰与癌症的发展有关，可以促进异常细胞行为或抑制它。包括CDTs和CIF在内的细胞周期抑制剂阻止细胞分裂，并预期通过抑制淋巴细胞群的生长来削弱人体的免疫系统。另一方面，像CNF这样的细胞周期刺激剂鼓励细胞繁殖，同时干扰细胞增殖。B.T.，如DT、CPE和PE，这些毒素专门针对这些毒素可能有助于靶向和杀死癌细胞，因为肿瘤细胞表达各种不同的抗原。这些DT在小鼠和人类癌症治疗中显示出希望，因为它们具有优化和理想的抗癌效果。
4.4.细菌孢子
孢子（厌氧菌）可能在肿瘤内部的死组织中发芽和繁衍，使它们成为对抗癌症的理想细菌类型。许多双歧杆菌、沙门氏菌株、大肠杆菌和梭菌被发现可以专门靶向并在低氧水平的区域根除癌细胞，提供针对性和特定的肿瘤治疗。C. novyi-NT菌株的卵泡，是一种经过工程编辑的无致命抗原的品种，显示出局部活性且无一般不良反应。当小鼠被瘤内注射C. histolyticum孢子时，观察到肿瘤组织的明显溶解。当小鼠被静脉注射C. sporogenes孢子时，也观察到了相同的效果。此外，在进行静脉（IV）药物测试的动物中，只在肿瘤中发现了梭菌，而不是在正常器官中。
4.5.细菌素
它们是由各种细菌物种通过其核糖体产生的带正电荷的肽。细菌素对癌细胞表现出特异性毒性，是可生物降解的，并且不引起免疫反应。这些细菌素可能与其他癌症治疗一起工作以对抗癌症。相反，它们会绑定到肿瘤细胞膜而不是正常细胞膜，正常细胞膜缺乏电荷，因此不利于细菌附着。这是因为大多数肿瘤细胞膜具有阴离子特性。由肠杆菌科如大肠杆菌分泌的细菌素，如大肠杆菌素，已显示出对多种肿瘤细胞系的抗肿瘤效果，包括体外的乳腺癌、结肠癌、骨癌和HeLa癌细胞。
5.用作抗癌的不同微生物
5.1.梭菌
由于其自然的厌氧特性，对梭菌的研究开始了。癌症组织中低水平的氧气和细胞死亡使它们对传统疗法产生抵抗力。研究最多的菌株之一是梭菌novyi，它是一种革兰氏阳性的、严格的厌氧菌和孢子形成微生物。它正在被探索用于开发诱导细胞死亡的癌症治疗疗法，特别是在预后不良的病例中。C. novyi-NT，其毒素基因被删除，可以选择性地定植在癌症组织上，并因减少外毒素产生而表现出较少的负面影响。它在涉及肉瘤、肾癌、中枢神经系统癌和结直肠癌（CRC）的研究中显示出希望，在那里它被用来研究选择性定植、免疫细胞浸润和导致癌症组织死亡的细胞因子释放。一位对传统疗法有抵抗力并且有多个转移的腹膜后平滑肌肉瘤患者，在瘤内治疗后右肩的肿瘤缩小了。这种局部治疗方法被推荐用于系统性注射以最小化副作用。目前正在进行进一步临床试验的患者招募。免疫系统细胞对癌细胞表现出攻击性，诱导它们死亡而不伤害正常细胞。这个过程发生在细胞发芽后，触发炎症反应。这些衍生物已被用作遗传工程中的细胞因子如TNF、IL-12和IL-2的递送系统。目标是在肿瘤内实现这些细胞因子的最大浓度，同时最小化系统性伤害。此外，C. novyi-NT和C. sporogenes刺激释放针对HIF-1的特定免疫球蛋白（抗体），HIF-1是参与癌症中低氧条件（缺氧）反应的主要元素。这种菌株的溶瘤特性通过基因疗法得到增强，取得了有希望的结果。梭菌sporogenes的肿瘤靶向特性使其成为宝贵的工具。硝基还原酶（NR）和CD编码由大肠杆菌衍生的基因促进。通过这些酶在肿瘤内代谢强效药物实现体内抗肿瘤效果。尽管它们不是高度免疫原性的，但梭菌孢子在系统性给药时可以侵入多个器官。
5.2.单核细胞增生李斯特菌（LM）
单核细胞增生李斯特菌（LM）是一种革兰氏阳性的兼性细胞内细菌，存在于体内。过去几十年的众多研究表明，它作为一种治疗肿瘤的治疗剂具有潜力，展现出多重效应和机制。在有利的免疫微环境中，它可以被用于原发性和转移性肿瘤。后者促进其选择性定植，而活性氧（ROS）的产生促进了它们的根除。LM还通过减少调节性T细胞和免疫调节物质如TGF和IL10来影响肿瘤微环境（TME）。然而，LM的主要特征在于其能够选择性感染抗原呈递细胞（APCs），促进外来和自身抗原的处理和呈递。这些特性使LM成为一种有价值的免疫刺激剂。基因工程已被用来研究LM的这些特性，并鉴定能够释放癌症毒素的重组菌株。这些菌株可以作为疫苗中的关键载体，增强细胞反应并克服对某些癌症的免疫耐受。这可以通过引入编码肿瘤抗原的质粒或将它们整合到细菌染色体中来实现。此外，这些毒素，如ActA或LLO，可以被展示为嵌合蛋白。LM利用ActA进行细胞间增殖和运动，增强了对免疫原性低的癌症毒素（抗原）的免疫反应。这项实验研究的目标是评估最近开发的疫苗的有效性，特别是检查使用LM-LLO-E7的宫颈癌模型。
5.3.沙门氏菌
由于其适应性，沙门氏菌属已被广泛研究为一种细菌。这些新工程化的菌株已显示出抗肿瘤活性。21世纪初进行了I期临床试验，以评估涉及msb-B和purI基因缺失的基因修饰的有效性。msbB基因的缺失旨在减少与TNF相关的毒性，这可能导致败血性休克。msb-B基因负责脂多糖A的合成。另一方面，purI基因的缺失使细菌能够选择性地定植肿瘤。因此，这些菌株变得依赖外部嘌呤源，它们的生长被限制在细胞更新率高的区域。这些菌株将特别定植在富含嘌呤的肿瘤组织中，这些组织提供了理想的环境。基于本论文的实验研究中使用的主要菌株是鼠伤寒沙门氏菌VNP20009。这项研究的结果确定了这种细菌的最大耐受剂量（MTD）、最大有毒剂量和不良反应，通过最大化促炎细胞因子的配方。观察到的负面影响包括血小板减少症、贫血、血液中持续存在的细菌、胆红素水平升高、恶心和呕吐、碱性磷酸酶增加以及血清中磷酸盐水平下降。只有3名患者显示出肿瘤定植的证据，没有肿瘤退缩的迹象。尽管这项研究的结果并不令人鼓舞，但它为未来的研究提供了起点，以识别可以增强效果、限制肿瘤和其他有益结果的修改剂量。启动了一项研究，以调查将它们用作肿瘤基因治疗的载体是否可以增强细菌的治疗效果。最初的研究是使用一种表达大肠杆菌自杀前药激活酶的修饰和减弱的沙门氏菌菌株进行的。TAPET-CD菌株是通过使用Donnenberg和Karper方法将这些基因插入VNP20009染色体而创建的。这种酶的作用机制涉及将5-氟胞嘧啶（5-FC），一种有限的细胞毒性抗真菌药物，转化为5-氟尿嘧啶（5-FU），一种可以诱导细胞凋亡的细胞毒性抗代谢物。不幸的是，结果并不乐观。接受治疗的三名患者中有两名没有显示出肿瘤缩小，尽管他们的病情似乎在改善。
6.基于微生物基因的癌症治疗的优势
• 具有高特异性的肿瘤靶向厌氧菌。
• 根据特定地理区域增加定制潜力。
• 能够通过身体迁移，在肿瘤区域积累并穿透癌细胞。
• 肿瘤组织对代谢物和细菌的增强脆弱性。
• 能够在体内复制和传播，消除了持续治疗的需要，并能够在治疗窗口内通过抗生素被抑制和控制。
7.基于微生物基因的癌症治疗的缺点
•由于频繁使用的困难，需要一个狭窄的治疗窗口来进行直接的肿瘤内注射。
•高反应性和无法溶解肿瘤和癌细胞使得败血性休克成为可能。此外，由于细菌的不可预测的致病性和其代谢产物，总的联合疗法带来了风险。
•存在由细菌及其代谢产物引起的不受控制的感染的风险。
8.结论
与癌症相关的死亡在全球越来越普遍，这要求我们开发有效的防御措施来对抗这一威胁。由于实体肿瘤的生理限制，身体吸收抗肿瘤化疗药物的能力受到严格限制。虽然传统的化疗药物仍然是主流，但由于其在各种活体生物研究中表现出的高特异性和抗癌效果，细菌疗法显示出了有希望的结果。然而，在临床环境中使用微生物作为抗癌药物仍然面临挑战。包括沙门氏菌、李斯特菌和梭菌在内的几种微生物已被探索作为替代的癌症治疗方法。预计未来，基因修饰微生物的诊断和治疗应用将增加。微生物的内在特性可以被修改并用于我们的优势。
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