没食子酸（GA）是一种多酚类化合物，具有抗炎、抗氧化和抗癌等重要生物活性，广泛应用于医药、食品、化妆品和化工行业。β-没食子酰葡萄糖（BGG）是GA的糖基化衍生物，具有抗糖尿病、抗氧化、抗增殖和抗炎效应。目前，GA和BGG的工业生产主要依赖于植物提取，但它们在植物中的含量较低。随着合成生物技术的发展，微生物合成GA和BGG成为了一种绿色高效的方法。
目前已报道了两种从葡萄糖生产GA的生物合成途径，均源自大肠杆菌天然莽草酸途径，使用赤藓糖-4-磷酸（E4P）和磷酸烯醇丙酮酸（PEP）作为前体。一条途径从分支酸延伸，由天然分支酸丙酮酸裂解酶UbiC催化形成4-羟基苯甲酸，然后通过来自铜绿假单胞菌的羟基苯甲酸羟化酶突变体PobA**（Y385F/T294A）连续羟基化为GA。工程菌株在摇瓶水平产生1.3 g/L的GA，产率为0.10 g/g葡萄糖。另一条途径从3-脱氢莽草酸（3-DHS）延伸，3-DHS被Klebsiella pneumoniae的DHS脱水酶（AroZ）羟基化，生成3,4-二羟基苯甲酸（3,4-DHBA）。随后，3,4-DHBA通过对羟基苯甲酸羟化酶突变体PobA*（Y385F）转化为GA。工程菌株在发酵罐中产生了20 g/L的GA，产率为0.12 g/g葡萄糖。虽然这些研究实现了利用葡萄糖从头合成GA，但途径酶活性不足导致产量较低，无法满足工业生产要求。此外，目前开发的GA生产菌株需要携带质粒，遗传不稳定，需要使用抗生素，不利于工业生产。
筛选合成GA的高效途径酶
首先对途径关键酶进行筛选。GA合成的第一步是3-DHS生物转化为3,4-DHBA，由3-脱氢莽草酸脱氢酶催化。苏云金芽孢杆菌的AsbF和假单胞菌的QuiC都表现出这种催化能力。因此，作者将asbF或quiC基因插入pZE12质粒并引入到大肠杆菌BW25113，分别产生菌株RX1和RX2。发酵结果显示，含有AsbF的RX1菌株仅产生0.31±0.01 g/L的3,4-DHBA。相比之下，含有QuiC的RX2菌株产生了1.61±0.06 g/L的3,4-DHBA，比AsbF高5.2倍，表明QuiC是中间体3,4-DHBA生产的最佳候选酶。
3,4-DHBA向GA的转化是GA合成中的第二个关键步骤。有研究表明苏云金芽胞杆菌的对羟基苯甲酸羟化酶三重突变体PobA***可将3,4-DHBA羟基化生成GA，转化率达到84%。由于相似的催化机制，作者推测恶臭假单胞菌的HpaBC也能将3,4-DHBA转化为GA。因此，作者将pobA***和PphpaBC基因插入pZE12并转化至大肠杆菌BW25113，得到RX3和RX4菌株。在补充了4 g/L的3,4-DHBA的培养基中发酵24h后，RX3菌株的GA产量高于RX4菌株，证实了PobA***是构建GA生物合成途径的更优酶。
图1 GA和BGG的生物合成途径
构建初始GA生产菌株
接下来，作者以大肠杆菌BW25113为底盘细胞构建初始GA生产菌株。通过共转化质粒pZE-PobA***-QuiC及质粒pCS-aroGfbr（增强莽草酸途径）获得初始GA生产菌株RX5。RX5菌株48h可产生2.35 g/L的GA。为了增加PEP的供应，作者进一步敲除丙酮酸激酶基因pykA/F，获得RX6菌株，GA产量提升至2.60 g/L。为了进一步提高PEP的可用性，作者通过敲除ptsG基因来失活磷酸转运系统（PTS），同时引入Glf和Glk促进葡萄糖的转运，得到菌株GJ1，其GA产量提升至3.32 g/L，产率提高至0.20 g/g葡萄糖，比RX6菌株增加了41.28%。然而，菌株GJ1的细胞生长速度减慢，表明与GA合成相关的代谢负担显著增加。
图2 构建初始GA生产菌株
构建无质粒的GA高产菌株
为了减轻代谢负担和增强稳定性，作者构建了无质粒的GA高产菌株。将aroGfbr和quiC基因分别置于P10trc启动子控制下并整合至基因组特定位点，得到菌株GJ3，该菌株在48h产生5.09 g/L的3,4-DHBA。进一步通过增加quiC基因拷贝数，得到菌株GJ6，其3,4-DHBA产量提升至6.08 g/L。将pobA***整合到菌株GJ6的基因组中，产生GJ10菌株，GA产量达到5.28 g/L，产率为0.29 g/g葡萄糖，且未观察到中间产物3-DHS和3,4-DHBA等的积累，表明需要将更多的碳通量转移到莽草酸途径中。
图3 通过微调代谢通量构建无质粒GA高产菌株
通过进一步强化莽草酸途径提高GA产量
为了进一步提高GA产量，作者的第一个策略重点是增加E4P供应。在大肠杆菌中，E4P由转醛缩酶TktA和转酮醇酶TalB直接产生。作者构建了一个talB-tktA表达框，并将其整合到菌株GJ10的基因组中。通过调节E4P供应成功使GA产量增加，其中GJ13菌株表现最佳，产量达6.23 g/L。接着，通过增强3-DHS生物合成途径中的关键酶AroG、AroB和AroD，进一步强化了3-DHS的可用性，GJ16菌株的GA产量达到7.16 g/L，产率为0.39 g/g葡萄糖。
为了评估扩大GA生产的潜力，作者在3 L发酵罐中进行补料分批发酵。GA的生产表现出生长耦合模式。在发酵的最初12h内，细胞生长缓慢，仅产生少量GA。随后，细胞进入快速生长阶段，至48h的OD600达到72.7。同时，GA产量在此期间急剧增加，达到最高产量51.57 g/L，产率为0.45 g/g葡萄糖，生产强度为1.07 g/L/h，是迄今为止报道的最高水平。
图4 通过进一步加强莽草酸途径来提高GA产量
图5 使用菌株GJ16在3 L发酵罐中发酵生产GA
筛选葡萄糖基转移酶以实现BGG的从头生物合成
从GA到BGG的生物合成需要葡萄糖基转移酶催化。作者通过文献和数据库筛选确定了两种潜在酶，拟南芥来源的UGT74F2和覆盆子来源的RiGT2。通过实验发现只有RiGT2能够催化GA生成BGG，产量达到438.62 mg/L。进一步地，作者将RiGT2转入GA高产菌株GJ16，成功实现了以葡萄糖为碳源从头合成BGG，产量为92.42 mg/L。这是首次实现从简单碳源合成BGG。
图6筛选葡萄糖基转移酶从头合成BGG
原文链接：
https://doi.org/10.1002/bit.28820
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摘译 | 卢其圆
编辑 | 王咏桐
左莎莎
陈嘉序
审核 | 刘 娟
