华沙生命科学大学：与鸡高致病性禽流感感染后生存相关的候选基因

全球家禽业一直受到高致病性禽流感（HPAI）的威胁，这种病毒不仅导致家禽大量死亡，还会引起产蛋量下降和相关经济损失。尽管已有研究关注于禽流感病毒的遗传特性和宿主免疫反应，但对于宿主遗传学在决定禽流感感染结果中的作用理解仍然有限。特别是在商业化饲养环境下，如何通过遗传选择提高家禽对HPAI的抵抗力，是一个亟待解决的问题。

在本研究中，通过对存活的鸡只和未感染对照组的全基因组测序数据分析，共鉴定出10,468,843个单核苷酸多态性（SNPs）。经过筛选，大多数变异位于内含子区域（超过45%）和基因间区域（约30%），而较少部分位于外显子和5'及3'非翻译区。这些SNPs的潜在功能影响进行了初步评估，其中超过98.5%的SNPs被归类为修饰类，意味着它们位于编码区域外，对蛋白质功能的影响较难估计。然而，包括转录因子结合位点或非编码RNA在内的调控区域内的所有变异也属于这一类，因此它们的生物学重要性不容忽视。少数高影响和中等影响的变异可能导致蛋白质编码的改变，这些变异虽然数量不足0.5%，但进行了更详细的分析。

图1.根据Ensembel（v86）转录本数据库的SNP变体分布

2.关联分析

在关联分析部分，研究团队在经过质量控制和多态性筛选后，使用了58,756个独立的SNPs进行多维尺度（MDS）分析。分析结果显示，来自两个不同商业农场的样本（标记为'D'和'M'）在分布上依赖于从存活者获得的DNA测序质量。特别是，来自M源的生存样本（MS）显示出最低的测序质量，这可能是它们与其他样本区分开来的原因。在10,468,843个总SNPs中，有6,263,749个在质量控制后被认为是有信息量的（等位基因频率MAF > 0.05，标记基因型率 > 0.8）。通过Plink进行的基本病例-对照测试中，全基因组显著性阈值设置为0.05除以独立分离的SNPs数量，即8.5 × 10^-7。总共有10个SNPs超过了全基因组显著性阈值。这些显著的SNPs包括位于Chr 1的SMPD1基因内的内含子变异，Chr 5的SYNJ2BP，Chr 8的ADAMTSL2L，Chr 10的DAPK2，以及Chr 20的ANGPT4，还有Chr 1的APBB1基因上游的一个变异，以及Chr 2的NRBP2基因上游的一个变异。由于覆盖度、序列质量和样本聚类的影响，进一步的调查使用了基于MDS分析的前两个主成分的校正。使用逻辑模型进行分析，缺失基因型率每标记设置为0.2，最小等位基因频率（MAF）设置为0.05。然而，对这些6,168,273个变异进行的分析没有发现显著的关联。

3.根据潜在功能影响选择SNP

在研究中基于潜在功能影响选择的SNPs部分，研究者们进一步分析了之前使用600 K Affymetrix SNP芯片在更大样本量（585个基因型样本）的研究中识别的区域。所有在当前研究中检测到的SNPs被选中进行进一步分析，这些SNPs基于它们预测的高或中等功能影响、GWAS p值<0.0001，并且位于我们600 K基因分型研究中识别的2 Mb区域内。所选变体如表3所示，包括Chr 1上的CAV2基因、Chr 4上的NR3C2基因、Chr 9上的CHRD基因和Chr 15上的RAN基因的突变。这些基因的特定变异可能对HPAI的抵抗力有重要影响，因此这些发现为理解禽流感的遗传抗性提供了重要的遗传标记，并可能有助于未来的抗性育种工作。

图2.来自多维缩放分析的前两个主成分

图3.病例对照关联检验的曼哈顿图（n = 70）

4.全基因组序列与600 K基因型之间的相关性

在“全基因组序列与600 K基因型之间的相关性”研究部分，对70个进行了全基因组测序的样本，研究者同样拥有这些样本的600 K Affymetrix® Axiom® SNP panel基因型数据。通过比较全基因组测序(WGS)数据与600 K数据，共鉴定了420,458个高质量SNPs。利用提升工具将600 K数据（基于Galgal4鸡参考基因组）转换为Galgal5坐标后，研究者们对每个数据集应用了质量控制阈值：最小等位基因频率(MAF)大于0.01和标记基因型率大于0.8。在过滤后，共保留了307,482个SNPs，这些SNPs与全基因组序列数据共享基因组坐标和参考等位基因。通过计算阵列衍生基因型与序列衍生基因型相同的比例，得到了基因型一致性(GC)，这对于大多数样本来说是相对较高的，并且与15X覆盖率的百分比呈指数级相关。研究还发现，低相关性主要是由于在覆盖度较低的区域，将杂合子错误地称为参考纯合子。这主要发生在15X覆盖率低于10%的样本中，以及平均覆盖率低于20X的样本中。这些发现强调了高质量测序数据在准确基因型分析中的重要性，并为使用WGS数据进行基因型推断提供了验证。

图4.基于全基因组序列和600 K SNP组调用的基因型之间的基因型一致

5.缺失基因型的归属

在“缺失基因型的推测”这一部分的研究中，由于全基因组测序数据中存在缺失基因型，研究团队执行了基因型推测流程。他们首先对基因组中的1%的SNPs进行了随机选择，并计算了推测准确性。推测缺失基因型的基因型一致性是基于12个样本进行的，这些样本被选中是为了代表序列质量的全范围。总共验证了58,833个位点。在对缺失基因型进行推测后，对病例和对照进行了关联分析，鉴定出26个显著的SNPs，但这些SNPs并没有与预先推测分析中的任何SNPs重叠。最强的信号出现在1、2、5、15、20和28号染色体上。与这些显著区域重叠的基因包括位于1号染色体的长非编码RNA (lncRNA)、2号染色体的AKAP9、5号染色体的SLC25A21、15号染色体的lncRNA、20号染色体的lncRNA，以及28号染色体上的一个新基因。这些结果表明，即使在测序数据不完整的情况下，通过推测可以揭示与疾病抗性相关的潜在遗传标记，这可能对理解复杂疾病的遗传学有重要意义。

图5.填补缺失基因型后的全基因组关联结果

6.从全基因组序列数据中识别插入和缺失（INDL）

在“全基因组序列数据中插入和缺失(INDELs)的鉴定”部分，研究团队在对数据进行筛选后，共保留了4,143,372个INDELs。这些INDELs的冲击和区域分布如Figure 6和Table 5所示。大多数插入和缺失发生在内含子区域。大约50%的这些变异位于基因间区域或者位于基因的下游或上游。研究者还测试了病例和对照之间INDELs频率的差异(见Table 6)。其中最显著的包括位于Chr10的CORO2B基因内含子区域、Chr19的RNFT1基因、ChrZ的PALM2基因内的INDELs，以及位于Chr10的ANP32A基因和Chr25的PRCC基因上游的INDELs。所有变异的影响和基因功能都是基于Ensembl v86数据库和基因本体术语确定的。

这项分析揭示了可能与HPAI感染后存活相关的新遗传变异，特别是那些在基因调控区域的INDELs，可能对病毒复制和宿主免疫反应有重要影响。这些发现为理解禽流感病毒的分子机制提供了新的线索，并可能有助于开发新的防治策略。

图6.按遗传区域注释索引

本研究通过对感染高致病性禽流感（HPAI）后存活的鸡只进行全基因组测序分析，鉴定了与生存相关的多个单核苷酸多态性（SNPs）和插入缺失（INDELs）。通过全基因组关联研究（GWAS），我们发现若干染色体区域含有与HPAI抗性显著相关的SNPs，这些区域包括了多个候选基因，如SMPD1、DAPK2和ANGPT4等，它们在细胞存活、炎症反应和病毒复制中可能发挥重要作用。

进一步的功能富集分析虽未发现显著的生物通路，但鞘脂代谢和病毒生命周期相关的基因显示了潜在的生物学相关性。这些基因可能与肌肉发育、能量代谢、卵泡发育和卵母细胞质量相关，为理解禽流感的感染和抗性提供了新的视角。此外，对优秀商业品种的基因分型表明，许多与HPAI抗性相关的SNPs在不同品系中存在多态性，这为未来的选择性育种提供了可能的遗传标记。

尽管本研究未能找到一个单一基因能在抗性中发挥决定性作用，但鉴定的遗传区域和候选基因为深入理解HPAI的病毒致病机制提供了基础，并可能指导未来的基因编辑研究和疫苗开发。未来的研究将验证这些发现，并探索这些遗传标记在不同禽流感病毒株和不同鸡种中的作用，以期培育出更具抗性的家禽品种。

https://doi.org/10.3390/ijms251810056

校对：Collin

投稿合作：shouyiyanquan@163.com