1、
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【在分子生物学工具酶还没有如当下这么进步的时期，长段DNA的克隆、拼接一直是个大问题。RNA重组机制是一个可行的路径】
2、RACE的技术（cDNA末端快速扩增法）
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| RACE（Rapid Amplification of cDNA Ends）是一种用于扩增特定RNA分子5'或3'末端的技术，主要用于获取完整的cDNA序列。RACE技术常用于研究基因的转录变体、测定基因的起始和终止位置等。 1. 基本原理 RACE的核心原理是利用特定引物在cDNA合成和扩增过程中获得目标RNA的末端序列。这一过程通常包括以下几个步骤： - 逆转录反应：首先，利用逆转录酶将目标RNA转录为cDNA。如果是3' RACE，通常会使用带有poly(A)尾的引物；如果是5' RACE，则需要使用特异性引物或接头引物。 - 扩增反应：通过PCR扩增cDNA，使用与目标序列特异性的引物。在3' RACE中，扩增会得到含有目标RNA 3'端序列的cDNA，而在5' RACE中，则能够获得目标RNA 5'端的序列。 2. 3' RACE技术 - 步骤： 1）RNA提取：从细胞或组织中提取总RNA。 2） 逆转录：使用带有poly(T)的引物合成cDNA，这个引物能结合mRNA的poly(A)尾。 3）PCR扩增：使用特异性引物结合cDNA的内部序列以及带有poly(T)的引物进行PCR扩增。 - 目的：得到目标RNA的3'末端序列，以便分析转录变体。 ![]()
【GSP:Gene specific primer】
3. 5' RACE技术 - 步骤： 1） RNA提取：同样从细胞或组织中提取总RNA。 2）添加接头：在mRNA的5'端加接头（通常是合成的寡核苷酸），这可以通过使用特定的酶（如RNA连接酶）来完成。 3. 逆转录：用接头结合的引物进行逆转录合成cDNA。 4. PCR扩增：用特异性引物和接头引物进行PCR扩增。 或如下：
利用TdT酶为第二链添加多聚C尾巴，然后扩增。
- 目的：获取目标RNA的5'末端序列，进而了解基因的转录起始位点。 ![]()
4. 应用 - 基因结构研究：确定转录变体、外显子-内含子结构。 - 新基因发现：鉴定新转录单位和功能。 - 基因表达分析：了解不同条件下基因的表达调控。 5. 优点和局限性 - 优点： - 可以快速获取RNA末端序列。 - 对于尚未完全注释的基因尤其有用。 - 局限性： - 对引物设计要求较高，特异性不足可能导致非特异性扩增。 - 需要高质量的RNA样品。 通过上述步骤和原理，RACE技术能够有效地帮助研究人员获取目标RNA的完整序列，进而深入理解基因表达及其调控机制。 |
REF:https://www.detaibio.com/topics/race-pcr.html
3、病毒干扰宿主干扰素反应的策略
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【敲除干扰基因，保留其他特征结构基因，达到减毒目的，拔了牙的老虎让免疫系统认识下】
| 阻断PRR信号通路：病毒可以通过干扰模式识别受体（PRRs）的信号通路来抑制干扰素的产生。例如，SARS-CoV-2的非结构蛋白nsp1可以抑制RIG-I样受体（RLRs）信号通路，从而减少干扰素的产生。2. 降解关键信号分子：一些病毒通过编码蛋白质降解宿主细胞中的关键信号分子。例如，寨卡病毒的NS5蛋白通过E3泛素连接酶介导STAT2的降解，从而抑制干扰素信号通路。干扰JAK-STAT通路：许多病毒通过干扰JAK-STAT信号通路来抑制干扰素的作用。例如，SARS-CoV-2的非结构蛋白NSP1、NSP3和NSP12可以抑制JAK-STAT信号通路，从而减少干扰素的信号传导。降解或挟持信号分子：一些病毒蛋白可以直接降解或挟持宿主细胞中的信号分子。例如，寨卡病毒的NS5蛋白通过E3泛素连接酶介导STAT2的降解，从而抑制干扰素信号通路。抑制干扰素刺激基因（ISGs）的表达：病毒可以通过多种机制抑制干扰素刺激基因的表达。例如，SARS-CoV-2的ORF6蛋白可以阻止STAT1和STAT2的核转位，从而抑制ISGs的表达。改变宿主细胞的microRNAs表达谱：病毒可以通过改变宿主细胞内的microRNAs表达，影响宿主细胞的功能，包括干扰素的产生和作用。病毒蛋白与宿主细胞因子相互作用：例如，SARS-CoV-2的Nsp1蛋白可以与宿主细胞的翻译起始因子相互作用，阻止宿主蛋白的合成，从而抑制干扰素的产生。形成双层膜囊泡：一些病毒如MERS-CoV利用病毒蛋白改变胞质膜结构，形成双层膜囊泡，阻断TLR3的识别，逃避RLRs的识别。病毒自身编码的micro-RNAs：这些micro-RNAs可以作用于宿主细胞的某些mRNA，直接或间接地干扰宿主免疫相关基因的表达。病毒为了逃避免疫系统的攻击而采取的多样化机制，甚至黑了免疫系统，有现实主义的味了。 |
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病毒之间进行基因组片段的交换可以导致病毒的减毒，这一策略在疫苗开发中得到了应用。例如，通过遗传重配技术，可以将弱毒株与强毒株的基因组片段进行交换，从而得到既能够保持免疫原性又减低了毒性的重配病毒株。这种方法在甲型流感病毒的疫苗研发中得到了成功应用，通过将冷适应的弱毒株与野生型强毒株进行基因重组，得到了减毒活疫苗。
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此外，通过反向遗传学技术，可以对病毒基因组进行定向改造，删除或减弱某些毒力基因，从而构建出减毒疫苗。例如，西尼罗病毒疫苗就是通过替换病毒3'非编码区（3' UTR）的某些序列，构建了减毒活疫苗。这种疫苗在动物模型中表现出了减毒特性，并能够诱导产生中和抗体，为疫苗的安全性提供了保障。
在SARS-CoV-2的研究中，研究人员利用合成基因组学平台，通过酵母合成病毒基因组，实现了对SARS-CoV-2的减毒和病毒拯救。这种技术不仅有助于理解病毒基因的功能和表达，也为开发新型疫苗提供了可能。
总的来说，通过病毒之间的基因组片段交换，不仅可以研究病毒的功能和致病机制，还可以用于开发安全有效的疫苗，这对于控制病毒的传播和感染具有重要意义。
