近年来，藻酸裂解酶因其降解产物具有免疫调节、抗氧化、抗过敏及促进植物生长等多种优异的生物活性，在海洋生物资源领域受到广泛关注。然而，由于野生菌株面临酶产量低、基因背景不清晰以及基因操作困难等问题，限制了其工业化生产和应用。基于组合策略，该研究旨在通过载体与宿主选择、启动子和信号肽筛选以及翻译起始区域的优化，在枯草芽孢杆菌中实现来自Vibrio natriegens SK42.001藻酸裂解酶Aly01的高效表达（图1）。这项研究不仅为异源表达藻酸裂解酶提供了有效的解决方案，还为其工业化生产提供了重要的技术支持。
图1 胞外表达起始菌株的构建策略
载体和宿主的选择
通过对载体进行筛选，发现携带质粒pP43NMK-Aly01的重组菌株表现出最高的细胞内酶活性，达到0.44 U/mL，因此选择了pP43NMK作为进一步研究的载体（图2A和C）。通过对不同宿主菌株进行筛选，发现枯草芽孢杆菌WB600表现出最佳的Aly01生产能力，酶活性达到了0.81 U/mL（图2B和D）。
图2 Aly01的载体和宿主选择以及酶学性质
枯草芽孢杆菌WB600合成Aly01的特性
通过对在枯草芽孢杆菌WB600中生产的Aly01的纯化和透析，验证了其结构的正确性。结果表明，Aly01的最适温度为35°C，最适pH值为8（图2E和F）。Aly01的比活力为99.89 U/mL，Km值为5.39±0.59 mM（表2）。这些结果与在大肠杆菌BL21中生产的Aly01相似，进一步证明了在枯草芽孢杆菌WB600中表达的Aly01具有正确的结构。
表2 大肠杆菌BL21和枯草芽孢杆菌合成Aly01的动力学参数
启动子筛选
通过对19个强启动子的筛选，研究发现PnprE、PaprE和PspoVG在Aly01表达中最为出色，酶活分别为4.47、4.37和4.25 U/mL（图3A）。尽管多个启动子提高了转录水平，但表达水平并非与转录水平完全正相关。SDS-PAGE结果进一步验证了上述结果，具有最强酶活的启动子在目标蛋白处呈现出最明显的条带（图3B），因此选择PnprE、PaprE和PspoVG启动子用于后续实验。
图3 启动子选择和双启动子酶活、转录水平以及SDS-PAGE结果
双启动子构建
基于启动子筛选结果，选取表现出最高活性的PnprE作为基础启动子，通过在其上游添加启动子，构建了双启动子C1（PaprE+PnprE）和C2（PspoVG+PnprE）。尽管转录水平显著提高（C1为P43的20.91倍，C2为P43的43.9倍），但酶活几乎没有提高（图3C）。SDS-PAGE结果显示C1的全细胞组分中目标蛋白显著增加，但大多为不溶性形式。未来可能通过RBS工程或NCS优化等方法来提高翻译效率，或通过分子伴侣的共表达来解决这一问题。
通过透明圈筛选最佳信号肽
为实现Aly01在枯草芽孢杆菌WB600中的分泌表达，构建了一个包含20个枯草芽孢杆菌内源信号肽的库（图4）。通过筛选信号肽库，得到了4个表现优异的重组菌株（SPaprE、SPbglS、SPydhT和SPvpr）（图5A）。通过进一步摇瓶发酵筛选，发现SPydhT具有最高的胞外酶活性，48 h时酶活达到1.33 U/mL。
图4 信号肽文库和RBS/NCS文库的构建策略
图5 通过LBSA固体平板和摇瓶发酵筛选胞外酶活
通过RBS和NCS工程提高胞外产量
通过对RBS和NCS区域的工程改造，构建了一个能够容纳 256 个变体的综合文库（图4B）。筛选得到7种表现出显著胞外酶活的重组菌株（图6A），并测定了所选重组菌株的发酵参数（图6B）。其中，4-G11在摇瓶发酵中具有最高的胞外酶活（4.58 U/mL）（图6C）。胞外上清液的SDS-PAGE分析显示，4-G11具有最明显的蛋白条带，与其胞外高酶活的结果一致（图7A）。
图6 RBS/NCS文库筛选和3 L生物反应器发酵结果
图7摇瓶发酵筛选和3 L生物反应器发酵的SDS-PAGE结果
补料分批发酵
在3 L的生物反应器中进行了补料分批发酵，重组菌株4-G11的胞外酶活在OD600为46.58时达到最高值（18.01 U/mL），远高于其在大肠杆菌中的最优表达水平（图6D）。SDS-PAGE分析结果进一步验证了胞外酶活结果（图7B），表明Aly01是目前枯草芽孢杆菌中表达分子量最高的藻酸裂解酶（超过60 kDa）。
原文链接：
https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acs.jafc.4c03532#tbl1
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摘译 | 陈嘉序
编辑 | 王咏桐
左莎莎
陈嘉序
审核 | 刘 娟
