Introduction
图1 混合油墨的工作原理及其在印刷中的应用示意图
Results and Discussion
1 混合生物墨水的相变行为
含二十二烷（docosane，D）和棕榈酸二十二酯（behenyl palmitate，B）的混合墨水（hybrid ink with DB，DBHI）在加热过程中，D和B的热流曲线显示出不同的相变峰，DB、D和DBHI中D在加热时的吸热焓大于冷却时的吸热焓。打印后D的正交晶体含量增加，形成针状晶体，其正交结构在打印过程中消耗非守恒能量，加速墨水冷却诱导凝胶化。通过COMSOL Multiphysics模拟和实验验证，DBHI墨水的温度降低速率比传统水凝胶墨水（hydrogel ink，HI）快，表明D的正交转变有助于提高打印结构的机械强度，人工或天然的烃类和酯类复合物（如蜂蜡）可能有利于使用混合墨水高保真打印结构。
a.差示扫描量热图；b. X射线衍射图；c.偏振光显微镜图；d.打印灯丝前后温度与仿真模型边界温度对比图；e.灯丝表面温度；f. 傅里叶变换红外光谱；g.加热过程的差示扫描量热仪图；h.冷却过程的差示扫描量热仪图；i. X射线衍射图；j.偏振光显微镜和扫描电镜图；k. 蜂蜡混合墨水（hybrid ink with beeswax，BHI）在打印过程中的能量和晶体变化。a～e. D、B、DB、DBHI表征；f～j. HI、BHI、氢化棕榈油混合油墨（hybrid ink with hydrogenated palm oil，HHI）表征。
2 生物墨水的3D打印适应性
蜂蜡是一种具有潜力的两相相变材料，由其组成的BHI经优化后流变性能和打印适应性良好。在打印过程中，BHI的屈服应力低于打印机额定屈服应力，表现出剪切稀化行为，黏度恢复率高且凝胶时间短，有利于连续挤出打印和层间黏附，其最大沉积高度高于HI和氢化棕榈油替代蜂蜡的HHI，能成功打印复杂结构，且该方法通用性强，适用于多种水凝胶基墨水，相比其他打印方案，BHI的保真性能更好。此外，BHI中蜂蜡与水凝胶的氢键作用及烃类晶体状态变化消耗能量，加速了凝胶化过程，解释了其高保真打印的能量消耗机制。
a.油墨在挤压阶段的剪切稀化行为；b.油墨在回收阶段的剪切恢复行为；c.油墨在回收阶段的温度恢复行为；d.打印结构的断裂强度；e.打印圆柱体的尺寸；f.打印倒A结构的尺寸与倾斜角；g.不同方法打印结果的比较及BHI策略对其他打印材料的普遍性；h.士兵模型；i.半月板和鼻子模型。
3 多孔水凝胶支架的形成与表征
从打印的混合墨水中蚀刻蜂蜡后，形成了互连多孔水凝胶支架。研究人员对其物理性质进行了全面表征，发现BHI细丝在0.125%戊二醛溶液中交联和蚀刻后，孔隙率高达58.03%（高于蜂蜡含量30%），溶胀率低（8.52%），具有自支撑能力和一定机械强度（破裂强度174.3 g，应力9733 Pa）。扫描电镜和共聚焦激光扫描显微镜观察到支架具有互连的微米级孔径孔隙结构（约100 μm），溶液扩散实验证实了孔隙的互连性。该多孔水凝胶支架无细胞毒性，细胞存活率达86.60%，且人皮肤成纤维细胞（human skin fibroblast，HSF）在培养7 d后可迁移至支架内部，细胞存活率提高至89.08%，表明其具有良好的体外生物相容性，适用于细胞生长和增殖，有望用于构建更复杂的异质结构用于组织工程。
图4 多孔水凝胶支架的形成、特性和生物相容性
4 体外构建真皮组织
为评估多孔支架支持复杂真皮构建的能力，研究人员用BHI打印了19 mm高的耳形支架。在HSF细胞培养21 d后，支架形状和弹性保持良好，细胞在支架内增殖、迁移并形成互连纤维网络，表达相关蛋白（如Ki-67、α-平滑肌肌动蛋白和胶原蛋白I），同时分泌金属蛋白酶降解水凝胶支架并合成新的细胞外基质，导致支架破裂强度略有降低。形态学和免疫组织化学分析表明，多孔水凝胶支架有利于细胞增殖和迁移，可用于体外构建真皮组织。
a.真皮培养实验示意图；b.不同时期培养的真皮结构的外观；c.不同时间培养后真皮构建体保真率（长、宽、高）和断裂强度；d.不同培养时间后，多孔水凝胶支架Masson三色光学显微镜观察；e.表皮分化标志物（Ki-67）荧光显微镜观察；f. Masson染色定量的肌纤维体积分数和胶原体积分数；g.定量的Ki-67；h.𝛼α-平滑肌肌动蛋白。字母不同表示差异显著（P≤0.05）。
5 体内生物相容性和肌肉缺损功能修复
多孔水凝胶支架植入大鼠皮下后，大鼠无防御反应或抓挠反应，体质量稳定，支架重量逐渐减轻，表明其可生物降解。组织学染色和免疫染色显示，支架有利于组织细胞快速增殖，无明显炎症反应和免疫原性，对大鼠器官无全身毒性，具有良好的体内生物相容性。构建大鼠胫骨前肌缺损模型，用BHI打印的高保真多孔水凝胶支架比HI打印的不规则支架更能促进肌肉收缩，提高大鼠腿部摆动幅度，表明高保真打印的组织模拟物对组织功能恢复具有重要意义。
a.实验示意图；b. 4 种水凝胶支架在植入后不同时间的大鼠示意图；c.植入后不同时间大鼠质量变化；d.多孔水凝胶支架植入后不同时间质量变化；e.苏木精-伊红染色图像；f.炎症细胞免疫荧光染色；g. CD3；h. CD68；i. MPO细胞密度定量评估，j.大鼠肌肉缺损外观；k.电刺激实验图；l.大鼠植入常规水凝胶支架或高保真多孔水凝胶支架后腿部摆动图像，未植入肌肉缺损大鼠作为对照。
Conclusion
