NC丨美国伊利诺伊大学Yong-Su Jin团队工程化酵母共生体调节混合糖发酵

微生物菌株过度的基因干扰会造成严重的代谢负担和高细胞毒性，导致底物转化效率低下和不良副产物的积累。通过交替改变初始群落组成和不同菌株的接种时间，可以更灵活地调节个别成员菌株的代谢能力以及整体生态系统的行为，从而提供单一菌株发酵难以实现的发酵性能可调性。为了验证这一观点，作者将发酵实验与数学建模相结合，研究了组成和时间变化对合成联合体中纤维素生物燃料生产的DOL的影响。该系统中的DOL通过创建两种专门化的酵母菌株来实现，这些菌株在有无其他糖的情况下分别专门发酵葡萄糖或木糖。通过混合消耗葡萄糖和木糖产生的乙醇被用作生态系统的可量化输出函数。随后，开发描述该联合体的糖消耗、增殖动力学和乙醇生产的数学模型，以提供定量洞察和预测指导。这项结合实验与数学的研究阐明了DOL在调节和优化底物消耗及乙醇生产方面的功能参数，并进一步强调了基于生态系统的工程在化学生物加工中的优势。

构建一个由葡萄糖和木糖特异菌株组成的联合体

为了克服混合糖利用的限制，作者首先创建两个分别仅消耗葡萄糖和木糖的专门菌株，在合成微生物群落中设计了分工（DOL）。具体而言，作者使用了具有木糖同化途径但缺乏主要六碳糖转运蛋白（Hxt1-7, Gal2）的酿酒酵母 SR8D8 作为母株。由于SR8D8菌株无法同时转运葡萄糖和木糖，作者向SR8D8中引入了一个葡萄糖特异性转运蛋白（AtSweet1*）和一个木糖特异性转运蛋白（LSNF），以构建初始的葡萄糖专门菌株（Y_G1）和木糖专门菌株（Y_X1）。单一底物的发酵实验表明，Y_G1和 Y_X1都专门用于消耗其相应的糖。然而，当使用葡萄糖和木糖的混合物时，Y_G1的消耗速率相对于单一底物条件仍保持较高，耗时12小时便能耗尽提供的葡萄糖。相比之下，Y_X1在混合葡萄糖/木糖培养基中的发酵速率显著降低，在经过24小时的滞后期后，完成木糖发酵需耗时100小时。这些结果表明，葡萄糖延迟并抑制了Y_X1菌株对木糖的消耗。作者推测，己糖激酶酶和细胞外葡萄糖可能参与了Y_X1菌株对木糖消耗的延迟和抑制。因此，作者在Y_X1中删除了编码己糖激酶和葡萄糖激酶的HXK1、HXK2和GLK1基因，创建菌株Y_X2。如预期的那样，Y_X2能够在存在葡萄糖的情况下快速消耗木糖，且没有滞后期。

图1 葡萄糖专门菌株（Y_G1）和木糖专门菌株（Y_X1）的构建

控制Y_G和Y_X的糖消耗速率

尽管这些改进，Y_G1的葡萄糖消耗速率（1.5 g/L/h）仍然几乎是Y_X2的木糖消耗速率（0.5 g/L/h）的三倍。由于这一消耗速率的差异，专门菌株Y_G1可能会在共培养中占主导地位，并通过乙醇的生产抑制Y_X2的生长，从而导致两种菌株之间的生长不平衡。为了匹配葡萄糖和木糖的消耗速率并增加菌株的可调性，作者将Y_G1中的AtSweet*替换为未经进化的AtSweet，以降低葡萄糖消耗速率，并在Y_X2中引入额外的LSNF表达盒以增强木糖的消耗速率。得到的菌株Y_G2和Y_X3的葡萄糖和木糖消耗速率分别相似（0.8 g/L/h和0.7 g/L/h）。当最初的专门菌株Y_G1和Y_X2以相同的细胞密度接种到葡萄糖和木糖的混合物中时，葡萄糖在24小时内被耗尽，速度远快于木糖所需的72小时以上。相比之下，优化后的专门菌株Y_G2和Y_X3在以相同细胞密度接种时同时耗尽了葡萄糖和木糖，这表明额外的工程成功地实现了葡萄糖和木糖的同时消耗。由于木糖发酵通常会积累抑制生长的乙酸作为副产物，为了消除乙酸对发酵进程的潜在干扰，Y_G2和Y_X3中额外删除了编码醛还原酶的ALD6基因。得到的菌株命名为Y_G2ΔALD6和Y_X3ΔALD6。

图2 Y_G和Y_X的受控糖消耗速率

组成性DOL调节联合体的发酵性能

通过将葡萄糖和木糖的消耗进行分配，工程化群落原则上可以实现对每种底物的单独控制和灵活调节利用动力学，从而通过直接改变初始生态系统组成来影响乙醇的整体生产。这种独特的控制程度在单一工程化菌株中是无法实现的。为了验证这一概念，作者对优化的群落进行了混合糖发酵实验。作者进行了50 g/L 葡萄糖和50 g/L木糖的混合物的联合发酵，并调节了两种菌株的初始细胞密度比，使用了1:9、3:7、1:1、7:3和9:1的Y_G2ΔALD6和Y_X3ΔALD6的比例。结果证实，通过改变初始组成，合成群落产生了不同的糖消耗动态和乙醇生产，并且底物的共消耗可以系统性地优化。值得注意的是，随着Y_G2ΔALD6在群落中相对初始细胞密度的增加，生态系统的葡萄糖消耗速率单调增加。与此同时，当Y_X3ΔALD6的相对初始密度从1:9减少到9:1时，木糖的降解也相应单调减少。这些结果表明，初始组成调节作为控制生态系统发酵行为的一种方法是有效的。此外，结果还显示，通过变化初始组成，乙醇的生产特征也得以调整。

图3 混合糖消耗的组成性DOL

时间性DOL是调节混合糖发酵的有效策略

与组成性分工相平行，通过在不同时间点将群落成员引入发酵中，时间性分工提供了一种替代的DOL方法。研究表明，在工程化酵母中，乙醇对木糖消耗的抑制作用比对葡萄糖消耗的抑制作用更为严重，因此同时共同利用葡萄糖和木糖会因乙醇的积累而显著影响木糖的利用。而理论上，连续培养发酵可以减少混合糖发酵中的乙醇毒性，但菌株污染的风险和高昂的产品回收成本可能使其在实践中难以应用。此外，葡萄糖专门菌株可能通过去除木糖消耗所需的溶解氧间接抑制木糖的消耗。如果混合糖被按顺序使用，即先用葡萄糖再用木糖，木糖的消耗将进一步加重，因为在葡萄糖发酵过程中产生的乙醇会产生抑制作用。因此，若先使用木糖再用葡萄糖，可能会缓解木糖发酵的严重乙醇敏感性，并增加木糖消耗所需的氧气供应。鉴于工程化群落的DOL设计，通过在葡萄糖专门菌株之前接种木糖专门菌株，这种木糖与葡萄糖的逆序利用在构建的生态系统中是可行的。因此，作者使用具有不同接种时间的葡萄糖和木糖专门菌株的联合体。为了在初始木糖发酵产生的高浓度乙醇存在下最大化葡萄糖的乙醇产量，作者首先通过删除ALD6来优化葡萄糖专门菌株的消耗速率，以最小化野生型S. cerevisiae D452-2中的乙酸产生，同时表达GFP以监测细胞密度。得到的菌株Y_G0ΔALD6在构建的所有葡萄糖专门菌株中表现出最高的葡萄糖消耗速率。Y_G0ΔALD6和木糖发酵专门菌株Y_X3ΔALD6形成了后续实验的合成生态系统。当使用合成联合体发酵混合70 g/L的葡萄糖和40 g/L的木糖时，作者观察到了葡萄糖和木糖消耗速率的不同以及不同的乙醇生产模式。当Y_G0ΔALD6的葡萄糖发酵在Y_X3ΔALD6的木糖发酵之前开始时，葡萄糖的快速发酵迅速产生了乙醇，从而抑制了木糖发酵。然而，当Y_X3ΔALD6的木糖发酵在葡萄糖发酵之前开始时，Y_G0ΔALD6的葡萄糖消耗并未受到积累乙醇的抑制。因此，整体乙醇产量显著增加。此外，在40 g/L乙醇条件下的木糖优先发酵，其木糖消耗速率通常快于在更低乙醇浓度下的葡萄糖优先发酵，这表明除了乙醇抑制因素外，如氧气不足等其他因素可能会导致木糖发酵的减缓。这些数据表明，通过将葡萄糖和木糖发酵进行时间性分工，优先消耗木糖，可以减轻乙醇对木糖发酵的抑制和可能的氧气不足问题。

图4 混合糖消耗中的时间性分工

数学建模捕捉组成和时间性分工的特征

为了定量理解发酵结果并阐明底物共利用的设计规则，作者采用基于常微分方程的方法开发了一个数学模型。该模型考虑了一个葡萄糖专一型和一个木糖专一型，它们分别消耗各自的底物以维持细胞活性、产生生物量，并以乙醇作为发酵的目标产物。对于每个专一型，其碳代谢围绕各自前体池的保护（R_g和R_x）展开，涉及来自糖消耗（J_g和J_x）和乙醇再同化（J_ecg和J_ecx）的流入，以及向细胞维护（J_mg和J_mx）、细胞生长（J_ng和J_nx）和乙醇合成（J_epg和J_epx）的流出。此外，细胞底物利用过程中存在调控，包括糖（葡萄糖和木糖）对乙醇再同化的抑制、乙醇对木糖消耗的抑制，以及辅因子NAD⁺在木糖利用中的参与。经过参数拟合，模型成功产生了联会的发酵模式，包括细胞密度（OD₆₀₀）、葡萄糖、木糖和乙醇在成分性分工和时间性分工存在时的表现。这些结果捕捉到了相应实验结果的特征行为。

图5 数学建模由木糖和葡萄糖专一型组成的合成群落

基于模型的底物共发酵预测与实验验证

随着作者模型在捕捉生态系统行为方面的成功演示，作者开始测试该模型是否能够提供对工程化 联合发酵优化的预测理解。作者首先使用模型模拟葡萄糖和木糖的共发酵，二者的浓度分别约为70 g/L和40 g/L，模拟中考虑了不同的初始菌株组成（即组成DOL）。值得注意的是，选择7:4的底物比例代表植物生物质水解液中葡萄糖和木糖的浓度，但模拟中初始底物浓度的具体值则基于实验测量的实际浓度。模型预测，共发酵的最大乙醇产量（即按底物重量标准化的最大乙醇生产）呈现非单调的趋势。具体而言，产量最初单调增加，随后达到平台期，最后随着葡萄糖专门菌的比例从0%变化到100%而缓慢下降。值得注意的是，尽管在初始葡萄糖专门菌丰度为42%时，乙醇产量（0.361 g/g底物）达到了单一最大值，但只要葡萄糖专门菌的比例在32%到53%之间，生态系统预测可以达到至少98%的最大产量（即0.354 g/g底物）。这些预测表明，平台期是平坦的，生态系统在广泛条件下能够达到几乎最优的性能。针对Y_G2ΔALD6和Y_X3ΔALD6的相应发酵实验结果证实了不同初始条件下的组成DOL确实导致了葡萄糖和木糖消耗的变化以及最大乙醇产量。此外，结果还确认了最大乙醇产量存在平台期，包括初始Y_G比例为3:7、4:6和5:5的情况，同时也确认了在显著不平衡的初始组成（例如1:9 和9:1）下生产减少的预测。这些结果再次证明，初始组成DOL是调节群落性能的有效参数，也确认了模型的预测能力。

接下来，作者使用模型揭示了在两种专门菌接种之间的不同时间延迟下的乙醇生产（即时间DOL），生成了乙醇产量的非单调曲线。这一结果捕捉到了之前发酵实验中最大乙醇产量的特征。它还表明，当时间延迟在14到29小时之间时，乙醇产量存在平台期（≥98%的最大值[0.368 g/g底物]），而当延迟超过29 小时时，产量会下降。为了进一步确认模型结果，作者进行了两个额外的发酵实验。与模拟结果一致，在27小时的延迟下，乙醇产量保持较高水平，但当延迟增加到40小时时，产量显著降低。为了进一步证明时间分工的有效性，作者使用该联合发酵含有56.5 g/L葡萄糖和35.2 g/L木糖的纤维素水解液，而不是直接的糖混合物。木糖专用菌Y_X3ΔALD6先接种，而葡萄糖专用菌Y_G0ΔALD6则在木糖剩余10 g/L时接种。结果显示，在42小时内成功消耗了葡萄糖和木糖，最终产生了39.5 g/L的乙醇。该结果表明，时间分工为合成微生物联合提供了强大的能力，以降解纤维素水解液中的混合糖。

图6 模型预测与实验验证共发酵调节