MCF丨查尔姆斯理工大学：代谢工程改造酿酒酵母提高紫杉二烯产量

为了设计上游途径，作者利用了专门为倍半萜生产而设计的现有背景菌株(SCIGS22a)。为了创建SCIGS22（SCIGS22a的背景菌株），对于酿酒酵母进行工程改造，通过增强通过FPP的通量并阻断通过甾醇生物合成的途径分支点。这涉及过表达ERG20和tHMGR、下调ERG9以及删除LPP 和DPP1，从而实现倍半萜产量的提高（图1）。SCIGS22a是通过在SCIGS22中过表达tHMG1创建的。由于FPP也是紫杉二烯的前体，作者使用该菌株作为进一步优化的基础，旨在提高紫杉二烯的产量。第二个背景菌株MVA是通过在SCIGS22a中过度表达六个甲羟戊酸途径基因（ERG10、ERG13、ERG12、ERG8、ERG19、IDI）而创建的。因此，作者对这两个工程菌株进行了比较研究。作为下游紫杉二烯途径策略，作者创建了16种不同的游离质粒，其中包括4种基因的组合：来自加拿大红豆杉的异源密码子优化GGPPS合酶、来自短叶红豆杉的TS以及甲羟戊酸途径的关键通量控制步骤tHMG1和ERG20。质粒包含 tHMG1和ERG20中的一个或两个或都不包含，而GGPPS和TS存在于所有质粒中。此外，还在质粒品种之间创建了GGPPS-ERG20和GGPPS-TS的融合蛋白以及反向方向。通过将上游途径与代表下游途径的游离质粒之一相结合，作者总共构建了32个菌株。对这32个菌株进行了分析，以确定能够在酿酒酵母中生产高紫杉二烯的最平衡途径。根据工程策略，成功地将紫杉二烯的产量提高到528 毫克/升，这是迄今为止摇瓶培养中报告的最高滴度。

图1 SCIGS22a生产大量异戊二烯的工程策略

增加酿酒酵母中FPP的通量，作者创建了三种不同的整合盒。每个整合盒由2 个基因组成，受双启动子(pTEF1-pPGK1)、终止子和之前确定的染色体整合位点上游和下游的控制，用于同源重组。为了构建整合盒，从质粒pBS01中扩增出一个双启动子。使用为重叠延伸而设计的引物，通过PCR从CEN-PK113-5D的基因组DNA中扩增出基因ERG10、ERG13、ERG12、ERG8、ERG19和IDI，从质粒pXI-3中扩增出XI-3的第一个整合盒上游位点（包含 tADH1）和XI-3的下游位点（包含标记URA和终止子tCYC1）（图2A）。凝胶纯化的亚基；XI-3-up、ERG10、启动子、ERG13和XI3-dw采用一步PCR融合，摩尔比为1:3:3:1。第一个PCR产物用作第二轮PCR的模板，使用引物Fus1F和Fus1R以及PrimeSTAR HS DNA聚合酶进行。为了将第一和第二个整合盒一起转化，第二个盒使用了一个新的可回收显性标记盒amdSYM。

图2 A–C染色体整合构建体

在本研究中，作者进一步改造了SCIGS22a菌株以产生MVA，然后在组成型启动子下过表达甲羟戊酸途径中的六个内源基因，以提高可能的生产能力。第一个尝试是将一个含有在PTEF1和PPGK1启动子的控制下独立表达的TS和GGPPS的基本质粒转化为SCIGS22a和MVA，分别产生菌株HK1和HK17。然而，预期相反，基于SCIGS22a的菌株HK1产生的紫杉二烯含量（109.7毫克/升）高于基于MVA的菌株HK17（2.9毫克/升）（图3）。Malcı等人使用OptForce的研究结果表明，甲羟戊酸途径早期步骤中基因的过表达不会导致紫杉二烯通量的增加。另一方面，一些研究表明，所有甲羟戊酸途径基因的过度表达，可以有效合成所需的最终产物，包括紫杉二烯。这可能表明上游和下游途径之间所需的通量已经达到良好的平衡。为了确定最佳、平衡的途径，作者使用了模块化方法，从之前的成功研究中汲取灵感，为下游途径创建了多种组合。先前的研究表明，连续酶之间的分子相互作用有利于GGPP在体内通过底物通道有效转化为二萜。因此，在PTEF1启动子的控制下以TS-GGPPS和GGPPS-TS方向融合了TS和GGPPS。在HK5中TS-GGPP方向获得的滴度为277.8 mg/L，在HK21中为7.9 mg/L（图3）。因此，在融合组合中，SCIGS22a和MVA背景菌株中观察到紫杉二烯产量显著增加，与单独表达TS和GGPPS相比，产量增加了近2.5倍。另一方面，包括GGPPS-TS方向的菌株HK9的培养产生了约76.0 mg/L的紫杉二烯，而在HK25们未观察到任何紫杉二烯滴度（图3）。当沿TS-GGPPS方向比对基因序列时，观察到MVA的结果增强，而反向方向在SCIGS22a中比MVA更具优势。一致的是，Ajikumar 等人表明，与反向相比，TS-GGPPS取向导致上游工程大肠杆菌菌株中紫杉二烯滴度增加。基于这些结果，可以断言，微小的修改可以在实现下游和上游途径之间的平衡方面产生显著差异。融合蛋白中不同基因取向之间观察到的蛋白质表达水平差异可归因于mRNA二级结构和加工的变化。这些因素会影响mRNA的稳定性和翻译效率。这些差异的一个可能解释是mRNA内形成了不同的茎环结构，尤其是在反向取向中。这种结构变异会影响mRNA有效翻译成蛋白质的能力。接下来作者为了研究在菌株设计中表达编码HMGR的截短形式的整合型HMG1的影响，作者旨在通过质粒表达它来评估其对紫杉二烯生产的影响。作者无法确定与HK2（12.6 mg/L）或HK18（无生产）细胞相关的任何高产量，其中包括分别表达的tHMG1、GGPPS和TS（图3）。同样，在表达TSGGPPS与tHMG1融合的HK6中以及表达GGPPS-TS与tHMG1融合的HK26中均未检测到紫杉二烯滴度。在HK22中分别表达TS-GGPPS和tHMG1融合的产量为11.4 mg/L紫杉二烯（图3）。分别表达GGPPS-TS和tHMGR融合体的HK10的培养产生了4.9 mg/L的紫杉二烯滴度。在研究中，作者证明了GGPPSTS融合体在SCIGS22a背景菌株中的兼容性，而TS-GGPPS融合体在MVA背景菌株中表现出兼容性。tHMG1与每个成功融合的构建体的共表达导致MVA背景菌株中的紫杉二烯滴度增加1.4倍，而在SCIGS22a背景菌株中观察到明显的15倍下降。早期研究表明，HMGR催化域的增加会诱导异戊二烯的产生；然而，必须注意的是，在这些研究中，tHMG1盒被整合到基因组中，但在本研究中，除了整合之外，它还通过游离质粒表达。

ERG20编码的法呢基二磷酸合酶催化香叶基二磷酸(GPP)和法呢基二磷酸(FPP)代谢物的形成，这是甲羟戊酸途径中的两个关键酶促步骤。在本研究中，ERG20在游离质粒中的表达受PPGK1启动子调控。MVA背景菌株HK19的紫杉二烯产量明显下降，为0.08 mg/L，而菌株HK3的滴度为47 mg/L。对于含有TS-GGPPS融合和ERG20表达的质粒，SCIGS22a没有观察到明显的产量。相反，MVA背景菌株HK23产生了30.9 mg/L的紫杉二烯。当GGPPS-TS融合和ERG20分别表达时，MVA背景菌株的紫杉二烯产量最高，为64.0 mg/L。培养HK11可产生25.9 mg/L的紫杉二烯。预期结果是，所有含有TSGGPPS融合的MVA背景细胞在紫杉二烯生产方面均比 SCIGS22a背景细胞具有优势。然而，在加入ERG20后，在MVA背景菌株中表达含有GGPPS-TS融合基因的质粒，在MVA背景菌株中获得了最高的紫杉二烯结果。这些结果表明，在流量发生微小变化的情况下，可以实现良好的平衡。GGPPS和TS融合的结果促使作者构建ERG20和GGPPS之间的融合，这两种酶催化甲羟戊酸途径中的相邻步骤。表达ERG20-GGPPS和GGPPSERG20融合的质粒被设计为在PTEF1启动子的控制下分别包含 TS。我们的结果表明，与HK13菌株相比，ERG20-GGPPS 融合使HK29菌株中的紫杉二烯滴度增加了2.6倍。同样，ERG20和GGPPS的反向融合保持了相同的比例，HK31菌株的滴度仍然比HK15高出大约2.2倍。与SCIGS22a背景细胞相比，涉及ERG20表达的每种组合在MVA背景细胞中都表现出更高的紫杉二烯产量。然而，在这些融合组合中并未达到以前的MVA菌株所达到的最大产量，而且产量几乎减少了两倍。先前的一项实验研究报告称，ERG20与萜烯合酶一起表达时可显著提高异戊二烯类化合物的浓度。蛋白质复合物的形成具有生物学意义，因为它使活性位点更紧密地结合在一起，促进有效的底物通道，并防止中间体被其他酶扩散和降解。最近的蛋白质组学研究证实了蛋白质复合物的共性，强调了它们通过有效的底物通道增强特定途径的作用。如先前报告所示，前体的可用性和蛋白质溶解度的增加可能是所需产品产量增加的主要原因,根据作者的研究结果，在具有MVA背景的菌株中，任何涉及ERG20、GGPPS和TS的融合都产生的结果超过了具有SCIGS22a背景的细胞中的结果。然而，在仅表达TS和GGPPS而不表达tHMG1和ERG20的SCIGS22a背景细胞中，实现了109 mg/L的显著紫杉二烯产量，这是迄今为止分析的组合中最有利的结果。这些结果强调了研究有效平衡两种途径的方案的重要性，而不是仅仅修改上游或下游途径。

作者最后进行了TS、GGPPS、tHMGR和ERG20共表达质粒组合中的紫杉二烯生产。在质粒组合中，这四个基因在不同的启动子下分别表达，HK4和HK20菌株的紫杉二烯滴度分别为2.1 mg/L和1.3 mg/L（图3）。最有效的菌株HK12含有TS和GGPPS融合物，tHMG1和ERG20分别表达，并且具有GGPPS-TS方向，在摇瓶培养中达到了迄今为止最高的紫杉二烯滴度528.5 mg/L（图3）。在HK16菌株中，GGPPSERG20 融合物的共表达以及分别表达的tHMG1和TS产生了显著高的紫杉二烯滴度445 mg/L，而菌株HK32的紫杉二烯产量有限，为24.4 mg/L（图3）。为达到较高的产品产量，下游途径与上游途径的容量相适应是很重要的。在本研究中，HK12和HK16菌株实现了良好的平衡途径。

图3 含有过量生产各种酶的构建体和游离质粒的重组酵母产生紫杉二烯