cGMP通路激活对小鼠脑缺血后神经发生的作用

文摘 2024-11-11 15:31 重庆

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如何引用

[1]校欢,承欧梅,韩萍,等.cGMP通路激活对小鼠脑缺血后神经发生的作用[J].检验医学与临床,2024,21(17):2470-2475.

关键词：脑缺血; 海马体; 神经发生; 一氧化氮; 磷酸二酯酶; 环磷酸鸟苷

目的

观察小鼠脑缺血后海马体神经发生的变化及其与环磷酸鸟苷(cGMP)相关调节机制。

方法

76只C57BL/6雄性小鼠按照随机数字表法分为假手术组和模型组,每组38只,采用双侧颈总动脉夹闭法建立脑缺血模型。采用Morris水迷宫检测其学习记忆功能,采用苏木精-伊红(HE)染色法检测海马体CA1区病理变化,采用免疫荧光法检测海马体齿状回神经发生标志物5′-溴脱氧尿嘧啶核苷(BrdU)、双肾上腺皮质激素(DCX)、BrdU/神经元核抗原(NeuN)阳性细胞数的表达,采用比色法、硝酸还原法分别检测海马体一氧化氮合酶(NOS)活性和一氧化氮(NO)水平,采用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测cGMP水平和磷酸二酯酶(PDE)9活性,采用Western bolt 法检测cGMP依赖性蛋白激酶G(PKG)、脑源性神经营养因子(BDNF)蛋白表达。

结果

脑缺血对小鼠的空间探索学习和记忆认知水平的影响 重复测量方差分析结果显示,两组小鼠逃避潜伏期存在时间、组间、交互效应(F时间=134.022、P时间<0.001,F组间=47.200、P组间<0.001,F交互=6.470、P交互<0.05)。单因素重复测量方差分析结果显示,假手术组小鼠不同训练天数逃避潜伏期比较,训练4 d<训练3 d<训练2 d< 训练1 d,差异有统计学意义(P<0.05),但训练4 d与训练5 d逃避潜伏期比较,差异无统计学意义(P>0.05);模型组小鼠不同训练天数逃避潜伏期比较,训练5 d<训练3 d<训练2 d <训练1 d,差异有统计学意义(P<0.05),但训练3 d与训练4 d逃避潜伏期比较,差异无统计学意义(P>0.05)。多变量方差分析结果显示,两组小鼠训练1 d逃避潜伏期比较,差异无统计学意义(P>0.05);但在训练2～5 d,模型组小鼠逃避潜伏期的时间同假手术组相比明显延长,差异均有统计学意义(P<0.05),见表1。在第6天的空间探索试验中,假手术组、模型组小鼠穿越平台次数分别为(6.67±1.37)、(1.67±0.51)次,模型组小鼠穿越平台次数明显少于假手术组,差异有统计学意义(t=8.300,P<0.05)。

表1 不同训练天数两组小鼠逃避潜伏期比较

注:与同组训练1 d比较,①P<0.05;与同组训练2 d比较,②P<0.05;与同组训练3 d比较,③P<0.05;与同组训练4 d比较,④P<0.05。

脑缺血后海马体组织病理学改变 脑缺血后第8天,假手术组小鼠海马体CA1区锥体神经元细胞核呈圆形且饱满,细胞结构清晰,排列紧密整齐;而模型组神经元细胞核呈不同程度的固缩、碎裂、溶解,细胞排列紊乱,间隙增大,见图1。模型组、假手术组正常锥体神经细胞数目分别为(18.00±5.88)、(84.00±6.16)个,模型组较假手术组明显减少,差异有统计学意义(t=15.48,P<0.001)。

图1 脑缺血后小鼠海马体CA1区病理的变化

脑缺血后海马体神经发生的变化 脑缺血后的第15天,通过对比计数发现,与假手术组相比,模型组小鼠的海马体齿状回颗粒下层BrdU和DCX阳性细胞数均有明显增加,差异有统计学意义(P<0.01);脑缺血后的第29天,模型组小鼠的海马体齿状回颗粒下层BrdU/NeuN阳性细胞数也明显增加,差异有统计学意义(P<0.001)。见图2及表2。

图2 脑缺血后小鼠海马体齿状回的神经发生的情况

表2 各组小鼠脑缺血后海马体齿状回新生阳性细胞数比较

注:*为脑缺血后第15天检测;#为脑缺血后第29天检测。

脑缺血后海马体NOS活性和NO生成的变化 与假手术组比较,模型组小鼠NOS活性和NO水平明显降低,差异均有统计学意义(P<0.05),见表3。

表3 各组小鼠脑缺血后海马体NOS活性和NO水平变化

脑缺血后海马体PDE9、cGMP及PKG、BDNF蛋白表达的变化 与假手术组比较,模型组小鼠PDE9活性降低,cGMP水平明显升高,PKG和BDNF蛋白表达均明显上调,差异均有统计学意义(P<0.05)。见图3及表4。

图3 脑缺血后小鼠海马体PKG和BDNF蛋白表达情况

表4 各组小鼠脑缺血后海马体PDE9、cGMP及PKG、BDNF水平的变化

讨论

脑缺血是一种严重的脑血管疾病,具有高发病率、高致残率和高病死率的特征,但对于脑缺血损伤,目前临床上还没有公认有效的防治手段。研究发现,脑缺血后内源性NSCs自我更新和分化的能力被激活,不断增殖分化为神经元,并逐渐发育成熟向受损区域迁移,最终整合进受损脑区周围的神经环路,形成神经网络以减少脑缺血损伤,为神经修复和认知功能改善提供了可能。但内源性神经发生的新生神经元数量十分有限,存活率非常低,与正常神经元在突触传递等方面也存在一定差异,内源性新生神经元不足以补充脑缺血患者损伤丢失的神经元。海马体在人类大脑学习和记忆等认知功能中发挥着重要的作用,促进海马体内源性神经发生已经成为脑缺血后神经认知功能修复的一个新方向。因此,深入研究其可能靶标和作用机制具有重要的意义。

本研究结果显示,脑缺血后,同假手术组相比,模型组小鼠海马体的CA1区锥体神经元细胞核固缩、碎裂,细胞间隙增大,排列紊乱,呈网状疏松状态,同时,正常锥体神经细胞数目明显减少,提示模型组出现脑缺血病理改变。在Morris水迷宫定位航行实验中,模型组小鼠逃避潜伏期明显延长;在空间探索实验中,模型组小鼠 60 s内穿越过平台的次数也明显较假手术组减少,这些结果表明模型组小鼠学习和记忆能力下降。上述病理和行为学检测提示脑缺血模型建立成功。BrdU是胸腺嘧啶核苷的衍生物,可在细胞周期合成时结合到DNA中,已被广泛用作活组织中细胞增殖和神经发生的标志物;DCX是一种新生神经元的特异性标志物,常用来检测海马体齿状回新生神经元的数量;NeuN是一种神经元特异性核蛋白,主要在成熟的神经元中表达。本实验中,模型组小鼠海马体齿状回神经发生标志物BrdU、DCX和BrdU/NeuN阳性细胞数均明显增加,提示模型组小鼠脑缺血后海马体出现了NSCs增殖分化、迁移,并发育为成熟的功能性神经元,出现了内源性神经发生。但是,模型组小鼠的空间探索学习及记忆等认知功能水平明显下降,提示脑缺血后虽然海马体出现内源性神经发生,但不足以修复和维持缺血损伤后的认知功能。

神经发生是由网状多靶标介导的一系列复杂机制调控的终产物。研究发现,cGMP-PKG通路可以介导脑血管舒张,促进侧支循环形成,减少梗死面积等。且PKG进一步诱导cGMP反应元件结合蛋白(CREB)磷酸化,促进BDNF转录,刺激细胞增殖、分化、存活等,从而参与调节海马体神经发生,改善神经损伤。本研究结果与之一致,小鼠脑缺血损伤后海马体出现神经发生,同时cGMP水平增加,PKG及BDNF蛋白表达上调,即cGMP-PKG通路被激活。

cGMP水平取决于GC和PDE作用的动态平衡。NO通过激活GC,使cGMP合成增加,而后经PDE水解,cGMP水平下降。现有研究发现,哺乳动物的PDE有11个亚家族。其中,PDE9是细胞内cGMP特异性的水解酶之一,其在海马体不同区域中广泛表达,与学习记忆和情绪密切相关。有研究提示,PDE9抑制剂在脑缺血后抑制细胞凋亡,促进神经元修复,产生神经保护作用。因此,NO和PDE9都可能是上调cGMP水平,刺激海马体内源性神经发生,改善认知功能的重要靶点。本研究结果显示,脑缺血小鼠NOS活性和NO水平降低,同时PDE9活性也降低。该结果提示,脑缺血后cGMP水平增加可能是由于PDE9活性降低,使cGMP水解减少所致;并不是通过NO激活GC而使cGMP生成增加。

目前,内源性神经发生在脑缺血损伤中的作用已经引起相关领域的广泛关注,PDE9-cGMP-PKG信号通路的激活可能在各种原因导致脑缺血后神经元损伤的自我修复中有重要意义,激活该通路或作用于相应靶点可加速受损神经组织的修复进程,改善患者认知功能障碍和促进神经功能恢复,降低患者的残疾率和病死率,提高其生活质量,减轻社会医疗负担。本研究结果为PDE9-cGMP作为脑缺血后神经损伤修复及相关新药研发的作用靶点提供了基础实验依据,在缺血性脑卒中的临床预防治疗方面具有较大的应用潜力,值得进行更多深入研究。

综上所述,脑缺血损伤后海马体内源性神经发生可能与PDE9活性降低,cGMP降解减少,从而激活cGMP-PKG信号通路有关。

（参考文献略）

以上内容有删减，原文《cGMP通路激活对小鼠脑缺血后神经发生的作用》2024年21卷17期

作者：校欢¹,承欧梅²,韩萍³,谭瑞⁴

作者单位：1.成都医学院第二附属医院·核工业四一六医院药学部;2.重庆医科大学附属第一医院神经内科;3.重庆大学附属人民医院医务处;4.重庆医科大学附属巴南医院药剂科

说明：本文为《检验医学与临床》原创文章，其他媒体、网站、公众号等如需转载本文，请联系本刊获得授权，并在文题下醒目位置注明“原文刊发于《检验医学与临床》2024年21卷17期”。

编辑：熊欣然

审阅：王明丰

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