罗汉果苷具有多种药理活性，主要从罗汉果中提取，并被广泛用作天然零热量甜味剂。然而，罗汉果的艰难种植和漫长的成熟周期导致了罗汉果苷的短缺。随着合成生物学技术的发展，生物合成罗汉果苷成为可能。UGT参与罗汉果苷的生物合成，UGT介导的糖基化可以将苦味罗汉果苷转化为甜味罗汉果苷。然而大多数UGT都表现出极低的催化效率。因此，挖掘具有高催化活性、宽底物范围的UGT成为生物合成罗汉果苷的关键。
UGT74DD1的鉴定和表征
作者克隆了6个在罗汉果转录组中高表达的UGT基因，其中一个基因编码一种可以糖基化罗汉果醇的酶，根据UGT命名委员会将其命名为UGT74DD1。使用UGT74DD1以及来自先前报道的UGT74家族成员的57个蛋白质序列进行聚类分析并构建系统发育树。系统发育树揭示了三个主要的进化分支，其中UGT74DD1与UGT74AC1表现出密切的进化关系，而UGT74AC1之前已被证实在罗汉果苷IE糖基化中发挥重要作用。体外功能分析表明，除罗汉果苷IIE外，所有测试底物都被UGT74DD1转化为糖基化产物。这些结果表明，UGT74DD1可用于在含有两个以上葡萄糖基部分进行初级糖基化。然而，UGT74DD1的催化效率有限，对初级糖基化反应的速率产生了不利影响。为了提高其催化性能，选择UGT74DD1进行下一步的蛋白质工程改造。
图1 UGT74DD1的功能表征
选择用于UGT74DD1定点进化的关键残基
UGT74DD1能够连续糖基化罗汉果醇以获得罗汉果苷IIE，但催化活性低。因此，作者对UGT74DD1进行蛋白质工程改造，进一步增强其酶活性，以满足罗汉果苷IIE的工业生产需求。作者使用AlphaFold模拟UGT74DD1的结构，然后通过分子对接及序列保守分析，选择了19个潜在残基进行进一步研究。采用丙氨酸扫描法，获得19个突变体，其中突变体G20A、Q373A和S278A酶活性比野生型显著增加。此外，W351A突变体（M1）表现出将罗汉果苷IIE糖基化为罗汉果苷III的能力，但催化活性较低。由于其将罗汉果苷IIE转化为罗汉果苷III的独特能力，突变体M1被选为第二轮工程的模板，继续扩大和增强其催化能力。
图2 UGT74DD1的模拟蛋白质结构和初步突变结果
MD模拟指导的突变位点预测
作者的目标是从M1（UGT74DD1-W351A）开始，通过进一步的诱变鉴定影响其酶活性的关键残基，最终目标是促进罗汉果苷III的高效合成。为了阐明M1催化活性的分子基础，作者对M1-UDP-Glc-mogrol进行了分子对接和无约束的MD模拟。M1表现出比WTUGT74DD1更灵活的结构状态。口袋周围保守残基之间的距离从WT中的6.5 Å增加到M1中的11.3 Å，以及M1中UDP-Glc-O（键断裂时提供糖基）和mogrol-C24-O（糖基相互作用位点）之间的距离主要集中在5.4 Å，而在WT中，它集中在7.8 Å。距离分布的变化表明突变体中蛋白质和底物之间的亲和力增强，从而促进了反应。结合自由能贡献的分解分析表明，WT和M1中底物残基相互作用存在显著差异，在活性口袋附近的残基中观察到能量值的显著改变，这与底物供体结合位点相对应。作者推测修饰对底物结合产生负面影响的功能性残基将增强酶的底物结合能力，同时提高其催化活性。因此，根据它们的结合自由能贡献和它们在活性位点周围4.5 Å范围内的空间接近度，系统地筛选出11个氨基酸残基（D17，G20，E49，E75，E135，S278，W330，Q335，T371，D372，和Q373）用于下一步的突变。
图3 M1（W351A）的MD模拟和关键残基的筛选
用于最佳突变体鉴定的迭代和组合循环
为了确定增强罗汉果苷III合成的潜在位点，基于M1（UGT74DD1-W351A）构建了新的单点饱和突变体文库，特别关注上述11个底物结合残基。随后，作者建立了一个包含209个双位点突变体的诱变文库，鉴定出6个相对活性升高的突变体。其中，W351A/Q373K双突变体（M2）表现出最高的相对活性，比单点突变体M1高出15.3倍。然后使用突变体M2作为起始模板，进行迭代组合突变，最终优选出突变体M6（W351A/Q373K/E49H/Q335W/S278C/D17F）。与M1相比，M6对底物的催化活性显着增加了46.1倍。
图4 突变体的功能筛选
图5 通过迭代组合突变筛选显性突变体
对最佳突变体的增强催化性能的见解
为了研究M6与M1的组合活性位点的影响，对M1-UD-PGlc-mogrol复合物和M6-UDP-Glc-mogrol复合物进行了MD模拟。MD模拟和理性分析表明，与M1相比，最佳突变体M6显示出增强的底物-蛋白质结合，从而提高了催化活性。
图6 组合突变体M6的催化机制分析
原文链接：
https://doi.org/10.1021/acs.jafc.4c04235
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摘译 | 卢其圆
编辑 | 王咏桐
左莎莎
陈嘉序
审核 | 刘 娟
