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代码地址：
https://github.com/cauzzo-s5/SENPAI
在细胞和亚细胞尺度上描述哺乳动物大脑连接组是神经科学领域的一个圣杯。大脑由数十亿个紧密排列的神经元组成。在脑组织中原位分离单个细胞对于描绘神经元的形状、大小和复杂性至关重要，这进而使得能够对细胞类型进行特征化，并识别出任何形态学异常以表征神经病理状况。树突棘是树突干上的微小膜状突起，可以与谷氨酸能轴突接触形成兴奋性谷氨酸能突触。1888年，Ramon Y Cajal首次使用高尔基染色技术描述了树突棘的形态。它们的三维形态可以通过金标准的三维电子显微镜来研究。最近，基于对小鼠新皮层树突棘颈部的超微结构分析，有人质疑是否存在不同类型的棘突，并提出了一个连续变化的棘突形态概念。树突棘接收电输入，这些输入受到棘突颈部几何结构和电阻的局部调控。在阿尔茨海默病患者和轻度认知障碍(MCI)患者中发现棘突密度减少和突触丢失，表明它们集体和个人在脑功能障碍中的作用。
已经开发了几种成像方法来探索不同空间尺度下的神经元结构。其中，单光子和多光子共聚焦显微镜是可视化原位或活体样本中神经元的主要工具，因为它们提供了深度成像解决方案，在XY平面上横向分辨率为180纳米，在Z方向上轴向分辨率为500纳米。另一方面，超分辨率显微镜（例如，激发损耗显微镜—STED）能够表征细小的树突棘。然而，脑组织容易散射光线，限制了组织内的成像深度（Z）。通过组织透明化和折射率匹配，可以改善共聚焦和超分辨率成像的表现，从而获得更大体积的数据集，并提高信噪比(SNR)和对比噪声比(CNR)，同时保持低激光功率。
随着大脑组织标记和微观及纳米尺度成像的进步，旨在实现高保真三维(3D)重建单个神经元的自动算法得到了广泛发展。最近关于这个主题的综述提供了超过四十种算法的分类点，每一种都利用了图像属性（例如，信噪比、点扩散函数、图像对比度）或神经元特征（例如，轴突管状、胞体球状、树状结构）的关键方面来开发定制的神经元重建策略。因此，它们的成功强烈依赖于采集方式和细胞类型以及所依赖的特征种类因此，开发通用解决方案通常是不切实际的。这些问题部分地通过元方法得到解决，即可以在基础追踪或分割算法之上使用的模块，以解决特定问题并改进结果。值得注意的是，大多数提出的基于显微镜图像的神经元分割算法不能处理用不同成像模式获取的神经元，而且只有少数能够处理密集堆积的细胞。
类似考虑也适用于基于人工智能(AI)的方法，如机器学习和深度学习，这些方法由于高质量和大量训练数据集的可用性而被成功引入。同样的原因，卷积神经网络最近也被引入。实际上，AI方法正迅速成为解决显微镜图像中神经元重建这一复杂问题的解决方案。然而，它们直接应用于以前未见过的数据（例如，不同的采集模式、细胞类型、SNR水平）很大程度上取决于训练集（例如，数据类型、训练样本数量），或是专门的解决方案（例如，迁移学习），这限制了它们的泛化能力。尽管现在正在付出相当大的努力来实现在深度学习模型中的可解释性，但它们的黑箱性质让用户难以控制诸如过度或不足分割这样的常见问题。另外，现有的基于深度学习的算法目前在处理图像块内多个结构的分离以及检索超出图像分辨率限制的信息（即，对于棘突形态或棘突颈部重建）方面存在困难。最后，无论使用何种方法，仍然需要专家手动修正和微调自动结果。
从澄清组织中获得的神经影像数据，这是一种清除高不透明组织脂质的方法，就图像质量（例如，增强的信号强度、SNR、CNR）和在三维排列中成像密集堆积细胞的能力而言，具有独特特点。但是，当处理来自密集堆积神经元的图像时，神经元重建算法的泛化能力甚至更低。此外，这种算法和工具的结果通常与人工分割的真实重建结果进行比较，这既耗时又难以实现，且易受人为偏见的影响。
鉴于这些挑战，作者设计了一个框架，通过成像和图像处理工具从脑组织中提取忠实的形态信息，涵盖神经元和亚神经元级别。具体来说，作者开发了一种处理和获取脑组织的方法，该方法返回代表神经元的大体积数据集，具有改进的图像质量。然后，作者提出了一种数据驱动的方法——SENPAI（利用偏导数信息的神经元分割）——从3D光学图像中分割神经元。SENPAI利用图像拓扑信息和K-means聚类提供多层次细节下孤立神经元形态的真实描述，而不依赖于构建图像信号和/或噪声模型。决策例程选择代表图像中神经元结构的类别。基于K-means的分割辅之以利用地形距离的划分步骤。作者采用形态学重建和分水岭变换来确保当神经元紧密堆积时正确分离。同样的策略用于将小棘突归类到特定位点的树突树主体上，在没有可检测颈部的高分辨率数据集中。
|匠心独运
图1：用于3D超分辨率STED显微镜厚样本成像的标记策略。A 将组织嵌入水凝胶中，并使用振动切片机切割6片（厚度0.5–1毫米）切片。B 通过在透明溶液中孵育进行被动澄清。C 使用专为STED设计的一抗和二抗荧光标记协议。D–G 将漂浮的切片安装在自制PVC间隔条中心的载玻片上。H, I 用prolong gold封片剂填充间隔条孔洞，并覆盖以超分辨率0.17毫米玻璃盖玻片。根据切片厚度，可以堆叠多个间隔条以保持盖玻片与载玻片平行。J, K 用硅胶将间隔条和盖玻片密封到载玻片上。L 小脑的共聚焦拼接成像。M 使用20倍物镜对浦肯野细胞进行共聚焦放大观察。N 对浦肯野细胞层进行常规3D共聚焦成像，并对细胞体周围区域进行专门放大（O）。P 单张3D STED显微镜图像，显示了整个树突树上装饰着的树突棘（白色箭头）。Q 多张3D STED堆叠切片的三维渲染，展示了深度内树突棘的高密度。比例尺：10微米。
|卓越性能
图2：SENPAI算法。A 测试数据集：40倍共聚焦（左）和93倍STED（右）。SENPAI在使用40倍共聚焦（27个神经元）和93倍STED（5个神经元分支）的数据集上对澄清样本进行了测试。B SENPAI的基本原理，基于选择沿三个主轴方向显示负值的第二导数类。C 估计K-means聚类中K参数的方法：所选K是使得二阶导数直方图显示出三类不同且平均值最大的那一个；这里，从D2x（沿x轴的二阶导数）的直方图来看，第3类（青色）编码了沿x方向的外部边界，因为它是唯一一个值明显大于0的类别；类似地，第4类编码了沿y方向的外部边界（D2y直方图）；第2类沿z方向（D2z直方图）；第1类同时编码了低强度和高强度均匀图像部分，并与第2、3、4类一起被标记为背景。D SENPAI工作流程—步骤1：在未经平滑处理的图像（顶部）以及可选地，在并行使用3D高斯滤波器平滑处理后的图像（底部）上进行K-means聚类。对每个聚类层次上的K-means类别独立执行类别选择（颜色编码如(C)所示）。产生的二值化图像（第一级聚类为绿色，第二级聚类为粉色，重叠部分为白色）通过逻辑或运算合并。E SENPAI工作流程—步骤2用于神经元分离：分割后的图像使用形态学重建和基于形态学重建灰度图像计算的3D分水岭变换进行划分，并应用于二值分割。左：原始图像；右：属于同一神经元的连接结构的隔离；胞体标记（黄色，由用户放置）定义了汇水盆地的井（边缘为灰色）。F SENPAI工作流程—步骤2应用于棘突分配。左：原始图像；中：3D渲染；右：带有神经元部分（例如，树突分支）与较小簇（即，树突棘）连接的划分2D渲染。被分配给单个神经实体的神经元簇组以不同的颜色显示在其相对的汇水盆地（灰色）中。
参考：
https://doi.org/10.1038/s41467-024-48146-y
