NS丨上海交通大学倪俊团队利用光驱动的二氧化碳合成挥发性、不稳定和光敏化学品

二氧化碳的增值利用对于实现碳中和和循环经济至关重要，但仍面临巨大挑战。通过光合作用微生物进行的光驱动合成生物学为将碳捕获与石化产品替代相结合提供了有前景的途径。然而，光合生物的基因工程分子工具和自动化工作流程远远落后于常用工业菌株的相关技术。此外，产物谱受到固有因素的限制，例如必要的气体交换导致挥发性产物容易逸散，以及光照诱导的光敏产物分解。另一个主要问题是由内源酶介导的目标产物的不良转化，完全消除这种冗余活性在尚未深入研究的光合菌株中极具挑战性。目前，对于这些长期存在的限制尚无解决方案，因此，开发一种普遍的二氧化碳增值利用策略以快速合成任何所需化学品具有重要意义。在本研究中，作者设计了一种广泛适用的二氧化碳增值策略，即光合作用与静止细胞催化（iPRCC）整合，以高效地将二氧化碳转化为多种增值化学品。作者在细胞催化模块中应用了多基因编辑和高通量工作流程，成功生产了挥发性苯乙烯、不稳定的细胞内醛类和光敏性分子。与光合单培养相比，这一iPRCC策略的整体催化效率提升了多达114倍。将该系统放大，用于直接将二氧化碳转化为产物，产量可达~2 g/L，每生产1吨目标化学品可固定数百万吨二氧化碳。这一高效的负碳路径极大地拓宽了光驱动生物合成的范围，并为循环经济开辟了一个有前景的机会。

为了评估iPRCC策略的可行性，作者选择了挥发性苯乙烯作为初始目标产品。作者首先生成了一个碳固定模块，基于一种快速生长的光合微生物Synechococcus elongatus PCC7942，将CO₂引导至稳定的中介化学物质—肉桂酸（CA）。CA被选为中介化学物质，因为它具有非挥发性、光稳定性、可分泌性且不被内源酶代谢的特性。在自然界中，苯丙氨酸解氨酶（PAL）催化内源性苯丙氨酸的脱氨生成CA，作者通过将各种PAL酶整合到S. elongatus 基因组中对其进行了测试。尽管工程菌株可以直接通过CO₂生产CA，但其初始产量（4.5–8.8 mg/L）过低，无法支持进一步转化。为了将固定碳引导到低通量的莽草酸途径中，作者使用了一个来自之前研究的抗反馈抑制（FBR）盒，包含两个FBR酶，作为非天然碳汇。令人瞩目的是，这一策略将CA的产量提高到156.2±4.1 mg/L（菌株S116），相比亲本菌株S112提高了25倍。S116成功地将超过30%的光合固定碳引导至莽草酸途径，且平均碳固定率相比野生型（WT）菌株提高了约50%。作者进一步进行了转录组分析，以探讨S116的全局变化。与大多数先前研究一致，光系统II（PSII）的主要亚基、电子传递蛋白、类囊体成分以及许多Calvin-Benson-Bassham（CBB）循环中的酶被上调，而一些光保护机制则显著下调。此外，PSII亚基的上调和光系统I（PSI）亚基的下调与较低的PSI/PSII比值可能减少光抑制的假设相吻合。光呼吸途径、乙酸激酶和醇脱氢酶被下调，这可能减少通过释放CO₂或副产物造成的固定碳损失。基于先前的研究，作者推测类囊体成分表达的增强可能有助于光呼吸途径转录水平的降低。上述观察结果进一步证明了光合微生物响应人工碳汇的复杂调控机制。储存多糖是S. elongatus中的主要天然碳汇，因此作者进一步研究了S116中它们的合成情况。虽然限速酶蔗糖磷酸合酶的水平没有显著变化，但蔗糖的产量下降了。令人惊讶的是，参与糖原合成的GlgC和GlgA表现上调，而促进糖原分解的酶则大幅下调。因此，通过增强的合成和抑制的分解，自然的糖原汇可能得到了加强。事实上，S116的糖原含量增加了17±2.3%，这部分碳分配可能与太阳能驱动的CA生产竞争。因此，作者通过敲除glgC基因构建了一个糖原缺陷型突变体，以转移糖原汇。然而，由于“碳汇限制”，该菌株表现出显著的生长迟缓。通过重新平衡光吸收和代谢汇，CA途径的诱导部分缓解了glgC缺失突变体的生长抑制。菌株S118的CA产量增加至173.3±6.3 mg/L，比生产率提高了23.4±4.5%。

图1 直接光合作用产生CA

在获得碳封存模块（CA过量生产菌株S118）后，作者进一步探索了不同的苯乙烯生产策略。作者最初调查了单一培养是否适合进行苯乙烯的光合生产。引入肉桂酸脱羧酶（FDC1），该酶催化CA的脱羧反应，直接从CO₂产生了4.2±1.1 mg/L的苯乙烯（菌株S119）。值得注意的是，异戊烯基转移酶（UbiX）生成了FDC1脱羧活性所需的异戊烯基黄素单核苷酸（prFMN）辅因子。作者推测，基于其与Synechocystis sp. PCC 6803中UbiX的高序列同源性，S. elongatus中的一种假设酶可能是异戊烯基转移酶。由于从S119中只能获得有限的苯乙烯浓度，其浓度可能被低估，因为苯乙烯具有高度挥发性，并且在光合生产过程中气体交换迅速。之前，双相有机-水相系统被用来解决导致E. coli液体培养中苯乙烯显著损失的蒸发问题，通过添加n-十二烷，苯乙烯的产生达到了15.3±1.6 mg/L，代表了264%的提高。然而，n-十二烷覆盖层的存在降低了细胞生长，苯乙烯的产量远低于S118的CA生产因此，在光合单一培养中，无论有机相的存在与否，获得理想的挥发性苯乙烯产量都是困难的。接下来，作者使用iPRCC策略进行苯乙烯生产，以验证其可行性。为了构建静止细胞催化模块，单独在野生型S. elongatus中过表达FDC1，形成S120。S120的静止细胞可以在添加10%（v/v）n-十二烷的有机-水相双相系统中，快速高效地催化CA转化为苯乙烯。通过将碳封存模块S118与静止细胞模块S120相结合，在10分钟内获得了109.8±4.6 mg/L的苯乙烯，与单一培养相比提高了26倍。整个过程中的苯乙烯生产约为11 mg/L/d，并且在转化过程中细胞密度和比例没有显著变化）。

图2 将CO₂光合转化为苯乙烯

作者随后直接从CO₂合成其他挥发性α-烯烃。首先设计了碳封存模块，将CO₂转化为酚酸。在S. elongatus中表达酪氨酸氨基裂解酶（TAL），将内源性l-酪氨酸转化为对香豆酸（pCA），结果株S121生产了6.1 ± 0.6 mg/L的pCA。通过进一步引入FBR酶，解除酪氨酸生物合成途径中的唯一反馈抑制，工程菌株S122在10天内能够生产134.5 ± 3.4 mg/L的pCA，这代表着22倍的改进。随后，将4-香豆酸3-羟基化酶（C3H）引入S121，并优化了核糖体结合位点（RBS），以提高咖啡酸（CAA）的产量。值得注意的是，合成RBS-3序列的菌株S126使CAA的产量提高到21.8±1.6 mg/L。在CAA生物合成途径的下一步中，涉及CAA被咖啡酸O-甲基转移酶（COMT）甲基化，整个合成途径的S128从CO₂生产了27.7±1.9 mg/L的芹菜酸（FA）。接下来，通过在S. elongatus中过表达酚酸脱羧酶（PAD），构建了静止细胞催化模块S129。根据iPRCC策略，通过将静止细胞模块S129与不同的碳封存模块（S122、S126或S124）接口，分别在10分钟内获得了92.4±2.2 mg/L的对羟基苯乙烯（pHS）、13.7±1.7 mg/L的3,4-二羟基苯乙烯（pVC）和18.4±2.1 mg/L的对乙烯基愈创木酚（pVG）。这些化合物是生产高性能聚合物的重要芳香单体。iPRCC策略的模块化特性也提供了各种“即插即用”的光合作用模块。例如，生物木质素增值通常受到技术经济可行性的限制，而我们推测这里开发的光合细胞催化剂更为理想，因为它不依赖于基于糖的原料。最主要的单体pCA和FA24可以在木质素丰富的农业废物碱性水解后以不同的比例释放。静止模块S129作为光合生物催化剂，可以同时将这些水解产物转化为最高2,475.2±4.1 mg/L的pHS和931.5±5.2 mg/L的pVG。这些结果表明，静止细胞催化模块在增值利用废资源方面的可行性。

图3 其它挥发性α-烯烃的光驱动生物合成

光驱动的CO₂转化利用自养光合微生物常受到冗余内源酶的阻碍。因此，依赖太阳能的制造不稳定的细胞内产品（如芳香醛类）仍然是一个持续的挑战。为了展示iPRCC策略的潜力，作者尝试将CO₂转化为桂皮醛。我们首先通过引入羧酸还原酶（CAR）和磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶（SFP）到过量生产CA的菌株中来扩展CA合成途径。然而，在改造后的S130菌株中没有检测到桂皮醛，因此推测桂皮醛被内源的醇脱氢酶（ADH）迅速转化。接着，作者删除了一个潜在的ADH基因，结果改造菌株S131产生了微量的桂皮醛（约1.1 mg/L）。芳香醛类易受多种微生物中超过十种内源ADH和醛酮还原酶（AKR）的代谢影响，要选择并敲除正确的基因以完全消除冗余活性，在尚未充分研究的光合菌株中具有挑战性。通过iPRCC策略，作者构建了一个能有效将CA转化为桂皮醛（CAD）的休眠细胞催化模块。在这里，E. coli被用作主要的底盘，因其具有复杂的基因工具和成熟的高通量工作流程，并且易于操作以消除冗余的内源酶。作者利用CRISPR-Cas9系统构建了一个RARE底盘，删除了E. coli中五个ADH编码基因和三个AKR编码基因，然后过表达了CAR和SFP。随后，通过将碳固定模块S118与催化模块E112连接，直接从CO₂中获得了125.1±2.0 mg/L的CAD，与单一培养相比提高了超过114倍。在10分钟的生物转化过程中，细胞密度和比率没有显著变化。香兰素是广泛使用的芳香醛类，也可以通过iPRCC策略从CO₂中生产。为此，作者将碳固定模块S128与下游异源催化模块E114结合，在10分钟内生产了18.1±0.4 mg/L的香兰素，与单一培养（S133，0.4 mg/L）相比提高了45倍。

图4 光合转化CO₂为细胞内不稳定产物

除了挥发性和不稳定的细胞内产品外，作者通过生成光敏产品进一步拓宽了光驱动生物合成的范围。由于光诱导分解，光依赖制造难以获得光敏产品。作者通过扩展FA途径并引入4-香豆酰辅酶A（CoA）连接酶（4CL）和姜黄素合成酶（CUS），直接从CO₂中合成了光敏姜黄素。由于改造菌株S134仅产生少量姜黄素（<1 mg/L），推测该光敏化合物在培养的光照过程中发生了分解。利用iPRCC策略，CO₂转化为姜黄素的途径可分为CO₂到FA的碳固定模块（光模块）和FA到姜黄素的催化模块（暗模块），以避免光诱导分解。由于S128可作为碳固定模块，应构建有效将FA转化为姜黄素的催化模块，以验证假设。首先，将4CL和CUS引入大肠杆菌（菌株E115）后，产生了8.8±0.5 mg/L的姜黄素。然后，敲除了内源姜黄素还原酶（CurA）（菌株E116），产生了11.5±0.4 mg/L的姜黄素。此外，过表达乙酰CoA羧化酶（ACC）以提高细胞内丙二酰CoA水平，使得姜黄素产量达到17.6±0.6 mg /L（菌株E117）。接着，为了进一步增强FA的生物转化，设计了4CL和CUS的非天然融合以引导底物进入连续反应。此方法中，设计和优化肽间连接子至关重要。通过结合先进的液体处理技术和人工蛋白生物传感器，作者探索了自动细胞外高通量（auto-CFHT）工作流程，以加速连接子优化。作者筛选了数百种连接子的库，发现柔性连接子16（L-16）表现最佳。这是迄今为止在体外生物合成中测试的连接子数量最多的研究。有趣的是，最佳融合蛋白具有更好的空间邻近性（更短的距离和更多的面对面通道），这可能解释了为什么其催化效率更高。用融合蛋白代替4CL和CUS使姜黄素产量提高到30.1±0.5 mg/L（E120，使用L-16），提高了71%。这里，体内和体外实验的结果显示了正相关性。随后，通过将碳固定模块S128与催化模块E120连接，直接从CO₂中获得了20.8 mg/L的姜黄素，与单一培养相比提高了46倍。在2小时的转化过程中，细胞密度和比例没有显著变化。另一个光敏化合物，东莨菪素，也可以从CO₂中生产。将碳固定模块S128与催化模块E121结合，生产了18.4±0.6 mg/L的东莨菪素，与单一培养（S135，0.3 mg/L）相比提高了61倍。研究结果表明，基于iPRCC策略的碳负灵活平台显著扩展了光驱动生物合成的范围。

图5 光合转化CO₂为光敏产物

iPRCC策略通过模块化设计实现了CO₂到分子的转化，这里开发的碳捕集模块能够将CO₂转化为酚酸，作为多酚生物合成的关键分子。因此，将这些碳捕集模块与其他具备互补路径的自养/异养催化模块相结合，可以产生一系列有价值的天然产品。为了验证这一概念，作者构建了三个新的催化模块（E122、E123和E124），以高效转化酚酸，此外还开发了用于CAD、香草醛、姜黄素和东莨菪素生产的催化模块。将碳捕集模块S118或S122与催化模块E122、E123和E124相结合，直接从CO₂中获得了143.6±5.3 mg/L的赤松素、152.7±4.3 mg/L的松属素、102.1±7.3 mg/L的天麻素、132.1±4.0 mg/L的白藜芦醇和122.5±2.9 mg/L的柚皮素。与之前在单培养体系（构建物SP-15和SP-16，来自S. elongatus）上的研究结果相比，使用iPRCC策略时，白藜芦醇和柚皮素的产量分别提升了63倍和31倍。值得注意的是，尽管这一方法可以方便地适应于广泛的商品化学品，但仍然有改进的空间。

接下来，作者旨在确定iPRCC过程在放大发酵中的适用性。碳捕集模块在12升的光生物反应器中培养，酚酸的产量至少提高了120%。通过将光生物反应器与1.5升的发酵罐相结合，成功实现了高达1.7 g/L的天然产品产量。该过程的生产力接近某些异养生物的水平，而这里获得的最高产量甚至高于许多利用碳水化合物的异养微生物。基于太阳能的生物制造的一项关键优势是其负碳足迹。如果不考虑植物生长过程中的碳吸收，传统的生物制造过程依赖于以糖为基础的原料，并与净正的CO₂排放相关联，这会加剧全球变暖，例如，每生产一公斤苯乙烯至少会释放11.9千克CO₂当量（kgCO₂e），每生产一公斤香草醛则为31.4 kgCO₂e。相反，基于太阳能的生物制造有效地将碳锁定在产品中。我们估计，通过使用iPRCC策略，每生产一吨目标产品可以封存17.2到180.9吨的CO₂（产品的负碳足迹为−17.2到−180.9 kgCO₂e/kg）。因此，这种易于开发和灵活的生物技术在负碳制造和循环经济方面具有独特优势。

图6 通过iPRCC策略实现的多种有价值化学品的负碳生产