原名：Identifying distinct markers in two Sorghum varieties for baijiu fermentation using untargeted metabolomics and molecular network approaches

译名：利用非靶向代谢组学和分子网络方法鉴定两个高粱品种在白酒发酵中的特异性标记物

期刊：Food Chemistry: X

IF：6.5

发表时间：2024.07

通讯作者：李伟丽，吴韬

通讯作者单位：西华大学食品与生物工程学院

在本研究中，我们通过非靶向超高液相色谱-四极杆-飞行时间串联质谱（UHPLC-Q-TOF-MS/MS）技术，全面分析了糟醅中的所有代谢物。如图S1所示，优化的总离子色谱图（TIC）清晰地展示了两组糟醅样本在20分钟内离子的分离情况。特别值得注意的是，TIC图谱中突出显示了两组样本中不同代谢物的显著峰值，这表明它们在代谢物分布上存在显著差异。

研究利用基于特征分子网络（FBMN）技术，分析了糟醅样品的化学成分多样性。在正离子模式下，我们共提取了24,030个节点（化合物），形成了22,666个分子家族（节点数≥2）（见图S2）。相反，在负离子模式下，共提取了19,956个节点，形成了17,893个分子家族（节点数≥2）（见图S3）。节点以彩色饼图的形式呈现，展示了两组样本中代谢物的相对丰度——红色代表糯高粱组，绿色代表粳高粱组。较大的节点对应于在GNPS数据库中鉴定的化合物，从而总共鉴定出267种化合物（见表S1）。这些代谢物可以广泛地分为16个类别，包括脂质及其衍生物（81种）、氨基酸及其衍生物（44种）、黄酮类（30种）、肽类（26种）、有机杂环化合物（18种）、酚丙酸类和多酮类（16种）、芳香族化合物（11种）、有机酸及其衍生物（9种）、生物碱及其衍生物（7种）、有机含氮化合物（6种）、有机氧化合物（6种）、其他（6种）、有机氮化合物（2种）、吲哚及其衍生物（1种）、木脂素、新木脂素及其相关化合物（1种）、有机氧化合物（1种）。脂质和氨基酸作为主要代谢物脱颖而出。括号内的数字表示每个类别中化合物的数量。

通过应用FBMN算法，具有相似MS²碎裂模式的化合物往往会聚集形成分子家族。因此，本研究进行了深入的手动分析，以探究鞘酯、小肽和黄酮类分子家族内部分子之间的结构联系，目的是直观地展示这些分子家族中存在的化学结构相关性。通过这种分析，我们能够为那些尚未被GNPS数据库收录的成分提供一个科学的推断基础。

在本项研究中，共鉴定出81种脂质物质，是糟醅中非挥发性代谢物中数量最多的一类物质。本研究所注释的脂质均属于鞘脂类，据我们所知，这是首次在糟醅中探索鞘脂。鞘脂具有高度复杂的结构，通常由三个主要结构部分构成，包括一个鞘氨醇碱基、一个羧酸烷基链和一个极性官能团。图1A展示了分子家族M1，涵盖了所有从糟醅中鉴定出的鞘脂化合物。图1B和C分别展示了D-赤型鞘氨醇和植物鞘氨醇的MS²谱图，突出显示了从GNPS数据库中匹配的化合物。在此，我们对不同分子家族的代表性成分进行了手动分析，以提高鉴定结果的可靠性。

在本研究中，化合物B的前体离子在m/z 302.3044 [M+H]⁺处被观察到，这与D-赤型鞘氨醇（Sphinganine）的质荷比相匹配（见图1B），其特征碎片离子包括m/z 284.2951、m/z266.2870、m/z 254.2834和m/z 60.0446。其中，m/z 284.2951是由前体离子失去一个水分子([M+H-H₂O]⁺)产生的，而m/z 266.2870来自于[M+H-2H₂O]⁺，m/z 254.2834则来源于[M+H-H₂O-CH₂O]⁺。此外，m/z 60是由主链断裂[M+H-C₁₆H₃₃O]⁺产生的，这是D-赤型鞘氨醇的一个特征性碎片离子。鞘氨醇中C₂-C₃键的断裂可确定它们是1-脱氧而不是3-脱氧化合物

化合物C的前体离子在m/z 318.2971 [M+H]⁺处被检测到，这与植物鞘氨醇（Phytosphingosine）的质荷比相对应（见图1C）。值得注意的碎片离子包括m/z 300.2865、m/z 282.2762、m/z270.2789和m/z 60.0432。这些碎片离子的发现，为进一步的结构鉴定和分析提供了重要信息。

2,5-二酮哌嗪（DKPs）是由两个α-氨基酸缩合形成的环状二肽，在诸如细菌和真菌等多种天然资源中被发现。

在本研究中，利用特征分子网络分析（FBMN）平台，我们鉴定了糟醅中的代表性肽类。图2A展示了分子家族M2和M3，分别代表环状肽和线性肽。图2B中，化合物B的母离子为m/z211.1439 [M+H]⁺。我们观察到一个特征碎片离子在m/z 183.1482处，这是通过从母离子中消除一个羰基团产生的，从而将其鉴定为环（亮氨酸-脯氨酸）（Cyclo(leucylprolyl)），这一结果与先前的报告一致。

遵循相似的模式，化合物C的母离子位于m/z197.1278，通过从母离子丢失一个CO分子，获得了特征离子m/z 169.1343。根据文献资料，该成分被鉴定为环（L-缬氨酸-L-脯氨酸）（Cyclo(L-Val-L-Pro)）（见图2C）。缬氨酸-脯氨酸衍生物通常对苦味有重要贡献。

化合物D的母离子位于m/z 245.1288，被鉴定为环（苯丙氨酸-脯氨酸）（cyclo(L-Phe-D-Pro)）（见图2D）。此外，化合物D通过从母离子丢失一个CO分子，生成了碎片离子m/z 217.1378。以往的数据还表明，基于脯氨酸的吡咯酮酮衍生物共享一个主要的产物离子质量m/z 70，与脯氨酸的离子质量相同。此外，二酮哌嗪类化合物以中性丢失为该类化合物的主要质谱裂解方式，主要包括- CO(28Da)和−OH(18Da)的丢失。

在分子家族M3中，化合物E（见图2E）的母离子质量为m/z 342.2383 [M+H]⁺，被鉴定为异亮氨酸-脯氨酸-异亮氨酸（Ile-Pro-Ile）。在m/z 114.091处，我们观察到可能发生C₂H₅（-29 Da）的中性损失。同时，m/z 86.0961处的离子表明存在异亮氨酸残基，而m/z 98.0607则对应于脯氨酸残基。这些观察到的碎裂模式与先前文献中报告的结果一致。

在本研究中，我们从两组糟醅样品中共鉴定出30种黄酮类化合物。图3A展示了黄酮类分子家族，而图4B-G分别展示了柚皮素、芹菜素、木犀草素、(S)-2-(3,4-二羟基苯基)-2,3-二氢-5,7-二羟基-4-苯并吡喃酮、三粒小麦黄酮和高圣草素的MS²质谱图。这些化合物在黄酮类分子家族中具有显著的代表性，其结构和生物活性在食品科学和医药领域均具有重要的研究价值。

在图3所示的质谱分析中，化合物B展现出一个显著的母离子峰，其质荷比（m/z）为273.0763，经过鉴定确认为柚皮素（naringenin）。此外，该化合物还产生了两个特征碎片离子，分别位于质荷比153.0181[M+H-C₇H₄O₄]⁺和119.0495[M+H-C₈H₈O]⁺。这些碎片离子的形成可以归因于逆狄尔斯-阿尔德（Retro-Diels-Alder, RDA）反应，进一步验证了柚皮素的分子结构。这些发现与先前的研究文献）的结果相吻合。

在图3所示的质谱图谱中，化合物E的质谱分析揭示了一个母离子峰，其质荷比（m/z）为289.0700，对应的分子公式为C₁₅H₁₂O₆。通过二级质谱（MS²）分析，观察到的碎片离子位于质荷比153.0194和137.0572，这些碎片离子的形成被归因于RDA反应。这些特征性的质谱数据初步将化合物E鉴定为(S)-2-(3,4-二羟基苯基)-2,3-二氢-5,7-二羟基-4-苯并吡喃酮（(S)-2-(3,4-Dihydroxyphenyl)-2,3-dihydro-5,7-dihydroxy-4-benzopyrone）。这一鉴定结果与前人文献的研究结论相一致。

在图3中，化合物F的质谱分析显示一个显著的母离子峰，其质荷比（m/z）为271.0586，经鉴定为芹菜素（Apigenin）。该化合物的母离子质量与节点B的母离子质量相差2 Da，且共享了质荷比153.0174和119.0500的碎片离子，这些特征性的质谱数据进一步确认了其为芹菜素。

类似地，化合物D经过鉴定被确认为木犀草素（Luteolin）（见图3），这一结果与先前的研究一致。

进一步地，化合物C和G作为一对同分异构体，其母离子的质荷比分别为m/z 303.0511 Da和m/z 303.0856。经过鉴定，它们被鉴定为三粒小麦黄酮（tricetin ）或高圣草素（homoeriodictyol）。由于它们连接基团的不同，这些黄酮类化合物在极性上表现出显著的差异。通过计算亲脂性参数（ClogP），可以有效地在反相色谱柱中预测同分异构体的保留时间，进而实现它们之间的区分。普遍规律表明，较高的ClogP值通常与更长的保留时间相联系。具体来说，三粒小麦黄酮的ClogP值略低于同高圣草素，分别为1.12和1.5。正是基于保留时间的细微差异，化合物C（保留时间RT = 7.89分钟）和G（保留时间RT = 9.72分钟）分别被初步推断为三粒小麦黄酮和高圣草素。

特征分子网络（FBMN）技术通过将已知的分子结构作为“种子”，在相同分子家族中推导出未知脂质的结构，展现出其独特的优势。这种方法利用了相似的质谱裂解模式来进行结构推断。我们通过分析鞘脂类家族的质谱裂解模式，成功推断出了化合物B、C和D的结构。值得注意的是，尽管这些结构在全局天然产物社交分子网络（GNPS）数据库中尚未被记录，但通过这种方法，我们能够对它们进行准确的结构鉴定（参见图4）。

化合物B的母离子在质谱分析中鉴定的质荷比为316.2830 [M+H]⁺，并且显示出特征离子峰位于m/z298.273和m/z 280.263（见图4B）。在鞘脂家族（第3.2节）观察到的特定裂解模式表明，母离子可能连续失去水分子，从而生成m/z 298.273和m/z 280.263的碎片离子。此外，与植物鞘氨醇（phytosphingosine）的2 Da质量差异表明化合物B可能含有一个双键，初步鉴定为4-羟基鞘氨醇（4-hydroxysphingosine）。

化合物C在质谱分析中显示一个母离子峰，其质荷比为316.3188 [M+H]⁺，其特征碎片离子包括m/z 298.312和m/z 280.302（见图4C），这些离子源自母离子分别失去一个和两个水分子的裂解过程。此外，与D-赤型鞘氨醇相比，母离子的质荷比显示出14 Da的偏差，这表明该化合物可能含有一个额外的-CH₂基团。通过参考相关文献，该化合物被初步鉴定为(2S,3R)-2-氨基-1,3-二羟基壬酸（(2S,3R)-2-aminononadecane-1,3-diol）。

化合物D的母离子在质谱中表现为m/z 300.2886 [M+H]⁺，其特征性碎片离子出现在m/z 282.28、m/z 264.27、m/z252.272和m/z 60.0439（见图4D），其裂解模式与植物鞘氨醇的裂解模式相似。因此，根据先前的文献资料，我们推断该化合物为鞘氨醇。

主成分分析（PCA）作为一种无监督的数据分析技术，其核心功能在于通过构建一组新的综合变量来实现数据降维。根据PCA分析的成果（参见图S4A），该模型展现出了显著的样本分类能力，成功地将样本划分为两个主要的聚类，充分体现了其卓越的区分效果。为了更精确地识别出造成两组样本差异的关键变量，我们进一步引入了正交偏最小二乘判别分析（OPLS-DA）模型进行分析（参见图S4B），该OPLS-DA模型的R²Y和Q²值分别达到了0.976和0.948，显示出其在模型拟合和预测方面的卓越性能。我们通过实施1000次的置换检验来评价OPLS-DA模型的预测力和稳定性，得到的p值显著小于0.001，表明该模型在区分样本组方面具有显著的能力，并且具有出色的拟合和预测性。

本研究采用VIP值大于1的标准，通过热图（见图5）识别出101种差异代谢物，这些代谢物在两个高粱品种的代谢组（FGs）中的影响被清晰地展现出来。这些代谢物被归类为13个类别：脂质及类似脂质分子（26种）、肽类（23种）、黄酮类（13种）、氨基酸及其衍生物（12种）、苯丙素和聚酮类（7种）、有机酸及其衍生物（5种）、有机杂环化合物（5种）、苯类化合物（2种）、有机含氮化合物（2种）、有机含氧化合物（2种）、其他（2种）、生物碱及其衍生物（1种）、木脂素、新木脂素及其相关化合物（1种）。括号内的数字代表每个类别中的化合物数量。这种详尽的分类提供了对不同代谢物的复杂分解，突出了它们在两个高粱品种的代谢组中的化学组分分布。

本项研究深入探讨了两种高粱品种在发酵过程中脂质及其衍生物的变化，发现共26种相关化合物表现出显著差异。特别值得关注的是，15种脂质及其衍生物在糯高粱的糟醅中含量显著高于粳高粱品种。在这些化合物中，磷脂酰胆碱（PC）类化合物，如PC (0:0/16:0)、PC (0:0/18:1)、PC (16:1/0:0)、PC (18:2/0:0)、PC (20:5/0:0)、PC (22:4/0:0)，以及磷脂酰乙醇胺（PE）类化合物，如PE (16:0/0:0)、PE (18:2/0:0)、PE (20:4/0:0)、PE (22:4/0:0)，均显示出显著的增加。与此同时，11种脂质及其衍生物在粳高粱品种中的含量则相对更高，尤其是植物鞘氨醇和鞘氨醇。此外，第二大类显著不同的代谢物中，环(L-苯丙氨酸-D-脯氨酸)、环(L-缬氨酸-L-脯氨酸)和环(L-脯氨酸-L-酪氨酸)等这些特定的化合物形成了一个引人注目的子类。

具体而言，糯高粱品种中的鞘脂、2,5-二酮哌嗪和蛋氨酸衍生物的水平比粳高粱品种高出1.21至1.71倍。理解这些变化可以为不同高粱品种酿造的白酒的独特风味特征提供宝贵的洞见。

为了揭示潜在的差异代谢途径，并深入理解这些高粱品种如何影响代谢产物的生成机制，我们以酿酒酵母为参考物种，进行了KEGG通路分析。在图6A中，每个气泡代表一个特定的代谢途径，气泡的大小表示其影响因子的大小。同时，颜色越深表示p值越小，表明该途径的富集程度更为显著。鉴定出的关键代谢物主要参与了16个代谢途径：氨酰-tRNA生物合成、鞘脂类代谢、精氨酸生物合成、苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成、辅酶Q和其他萜类-醌类生物合成、甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢、单环内酰胺生物合成、半胱氨酸和甲硫氨酸代谢、氰基氨基酸代谢、β-丙氨酸代谢、酪氨酸代谢、赖氨酸生物合成、硫胺素代谢、丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢、色氨酸代谢以及嘌呤代谢。

糯高粱品种在白酒酿造中历来被认为能够带来比粳高粱品种更丰富的风味特征。基于此，我们提出了一个假设：在发酵过程中，糯高粱能够产生一系列独特的非挥发性代谢物，这些物质对白酒的风味有着显著的影响。揭示这些代谢物与白酒香气之间的具体联系，对于理解影响白酒品质的关键机制具有极其重要的意义。然而，由于这些代谢物的复杂性，目前科学界对它们在白酒酿造中的作用尚缺乏深入的认识。本研究首次运用数据驱动的计算方法，对高粱枣皮中的这些难以捉摸的“暗物质”代谢物进行了系统注释，从而为深入探究其在白酒酿造过程中的生化作用提供了新的科学见解。

本研究中引入FBMN技术，相较于传统的局部数据库检索方法，显著提升了糟醅代谢物分析的效率和准确性。首先，FBMN技术通过分子家族分析，提供了对代谢物全景的宏观视角，我们根据共享的结构特征对代谢物进行分类。这种策略不仅简化了复杂的代谢物谱图，还促进了代谢模式的识别，极大地增强了代谢物注释的准确性和效率。

其次， FBMN技术突破了传统鉴定方法的局限，允许我们仅利用反应中的一个已知代谢物作为参照，来识别未知的代谢物。这种方法避免了对庞大数据库或多个已知标准品的依赖，标志着在代谢物鉴定领域的一个重大进步。FBMN技术通过分析二级质谱（MS²）谱图中的共有特征，极大地拓宽了我们探索未知化学领域的能力，提升了我们对新颖或稀有代谢物的发现和理解。这种创新方法不仅提高了鉴定的准确性，也为代谢物研究领域带来了新的视角和可能性。

FBMN技术，不仅优化了我们的分析流程，也拓展了化学探索的视野。这一技术使我们能够更深入地研究糟醅的代谢物特征，为发酵食品化学领域的未来研究奠定了坚实的基础。通过利用FBMN，我们得以细致解析糟醅复杂的代谢物谱，为相关领域的科学探索提供了强有力的支撑。

在众多鉴定出的代谢物中，本研究特别关注了白酒糟醅中三种关键的差异代谢物：鞘脂类、2,5-二酮哌嗪（DKPs）和氨基酸衍生物。这些代谢物在糟醅的代谢特征中扮演着至关重要的角色，它们的特定变化可能对白酒的风味和品质产生显著影响。

鞘脂类脂质是一类在结构上与磷脂相似但不含甘油主链的独特脂质。它们的生物合成过程以鞘氨醇作为关键起始分子（参见图6B）。这类脂质的特征在于酰胺键和较长的脂肪酸链（C20至C26），赋予它们与其他脂质类别不同的特性。研究指出，糖基鞘氨醇对酵母发酵特性有显著影响，尤其是在调节细胞膜的流动性方面。细胞膜流动性的增加与乙酸乙酯的生成减少相关联，乙酸乙酯是构成白酒香气特征的关键化合物之一。此外，鞘脂骨架中的9-甲基基团的存在可能抑制挥发性风味物质的形成，这表明鞘脂类在风味形成过程中可能发挥着复杂的调控作用。

2,5-二酮哌嗪（DKPs）的生物合成是由非核糖体肽合成酶（non-ribosomal peptide synthetase,NRPS）这一复杂而专业的酶系统所催化的。NRPS通过一系列精心协调的步骤促进DKPs的合成，每个步骤均由特定的酶域控制。DKPs展现出独特的化学性质，特别是它们拥有两个氢键供体和两个氢键受体位点，这使得它们能够参与氢键的形成。这一结构特性赋予了DKPs与多种生物靶标相互作用的能力，进而影响它们的生物学功能和感官属性。

在白酒的风味构成中，2,5-二酮哌嗪（DKPs）被认为对酒体的复杂风味特征有显著贡献，常常赋予白酒苦味、金属味或涩味等口感特征。这些感官属性在塑造白酒的整体风味感知中起着至关重要的作用，突显了DKPs在风味化学中的重要性。

高粱中的一种主要贮藏蛋白--高粱醇溶蛋白（kafirin），含量在DKPs的生物合成过程中起着关键作用。高粱的基因型和环境条件等因素会显著影响高粱中高粱醇溶蛋白的含量，进而影响糟醅中 DKPs 的含量，基因型的差异会导致蛋白质组成和表达的不同，而土壤成分、气候和农业实践等环境因素则会影响蛋白质的稳定性和可获得性。这些变化直接影响发酵过程，因为发酵过程中高粱醇溶蛋白的分解或释放是 DKP 形成的前体。

鉴于 DKPs 源自高粱醇溶蛋白，且对风味有显著影响，因此是白酒生产中进行质量控制的一个很有前景的途径。监测糟醅中DKPs的含量和水平可以作为一个可靠的指标，用于选择和筛选最适合白酒生产的高粱品种。通过建立DKP与白酒质量之间的相关性，生产商可以改进其发酵工艺，以提高风味的一致性和质量。这种方法不仅能改善白酒的感官属性，还能为培育和选育具有理想发酵特性的高粱品种提供科学依据。

在糯高粱与粳高粱的糟醅中开展的代谢物差异性分析，揭示了氨基酸及其衍生物在含量上存在显著差异，尤其是蛋氨酸的显著变化。蛋氨酸在风味形成中扮演着多面角色，它通过二羰基化合物的氧化作用，触发了Strecker降解反应，这一反应是生成具有强烈香气活性的醛类化合物（例如苯甲醛和甲基丁醛）的关键途径。这些化合物以其独特的花香、蜜香、麦芽香和巧克力香等特征香气，为白酒的香气谱增添了“迷人的色彩”。此外，Strecker降解与美拉德反应的相互作用，对于白酒风味的形成至关重要。美拉德反应是一系列复杂的非酶促褐变反应，是食品风味发展的基础。这种相互作用对于形成吡嗪类化合物尤为重要，这些化合物为白酒增添了泥土、坚果和烘烤的香气。

酵母中蛋氨酸的合成与硫酸盐同化途径紧密相关。这一过程需要大量的能量投入，体现了蛋氨酸在生物学上的重要性。硫酸盐转化为亚硫酸盐，再进一步转化为硫化物，涉及多个酶促反应，最终生成同型半胱氨酸，这是蛋氨酸的直接前体。同型半胱氨酸的甲基化过程，由叶酸循环促进，是蛋氨酸生物合成中的关键步骤，这突显了代谢途径与白酒中最终呈现的风味化合物之间的相互作用。

在糯高粱与粳高粱的糟醅中，蛋氨酸含量的显著差异可能源于硫酸盐同化途径的效率差异或参与蛋氨酸合成的关键酶活性的变化。深入探究这些代谢过程中的微妙变化，对于精细调控白酒生产中的风味形成至关重要。这种理解不仅有助于我们优化生产过程，还可能引领我们开发出具有特定香气特征的定制白酒。通过精确调节这些代谢途径，我们能够为白酒的风味设计提供坚实的科学基础。这不仅能够丰富白酒的风味多样性，还能够满足消费者对特定风味白酒的需求，推动白酒产业的创新与发展。

本项研究揭示了一系列创新性的发现，显著推进了我们对白酒酿造过程中生化机制的认识。借助先进的数据驱动计算技术——基于特征的分子网络分析（FBMN），我们成功地对267种先前未被识别的代谢物进行了注释，其中大部分是在高粱发酵过程中首次被发现。通过FBMN技术的应用，我们精准地识别出了对白酒风味特征形成具有决定性影响的关键代谢物。特别值得关注的是，鞘脂类、2,5-二酮哌嗪以及蛋氨酸等氨基酸衍生物在不同类型高粱中的差异化表现，这些发现为深入理解糯高粱如何增强白酒的风味特性提供了全新的科学视角。这些研究成果不仅丰富了我们对白酒风味形成机制的科学认知，也为白酒的风味优化和品质提升提供了宝贵的科学依据，进一步推动了白酒产业的科技创新和高质量发展。

考虑到代谢物、微生物和酶之间相互作用的复杂性，开展进一步的研究显得尤为迫切且具有时效性。特别值得关注的是，研究高粱中鞘脂类在发酵过程中对酵母的影响，这一课题无疑将成为未来研究的热点。通过深入探究这一领域，我们不仅能够更深入地理解鞘脂类在白酒风味形成中的关键作用，而且还能进一步揭示发酵食品风味发展的整体机制。这种研究将有助于我们全面揭示白酒酿造过程中的生化奥秘，尤其是鞘脂类对酵母发酵行为的调控作用。通过解析这些复杂的生物化学相互作用，我们能够为白酒的风味优化和品质提升提供更为科学和系统的理论支持，这对于推动白酒产业的科技创新和产品多样化具有深远的意义，同时也为发酵食品的风味调控提供了新的视角和方法。

这些研究成果为白酒生产领域提供了更为精准的质量控制策略，有望显著提升白酒的风味一致性和整体品质。通过深入挖掘那些错综复杂的代谢途径及其对风味形成的深远影响，我们不仅能够对白酒的生产流程进行优化，更在发酵食品的风味化学研究中做出了重要贡献。这种深入的科学探索不仅有助于提升白酒的生产工艺，确保其风味的稳定性和独特性，也为发酵食品的风味调控提供了宝贵的理论支持和实践指导。这对于推动整个食品科学领域，尤其是发酵食品产业的技术进步和产品创新，具有不可估量的价值。