5-氨基乙酰丙酸（5-ALA）天然存在于微生物、植物和动物细胞中，是合成四吡咯化合物（如血红素、卟啉、叶绿素和维生素B12）的重要前体。5-ALA广泛应用于农业、畜牧业和医药领域。在医学中，5-ALA被用于光动力学诊断以及治疗各种癌症和皮肤病。在农业方面，5-ALA作为植物调节剂，能够提高作物产量。预计到2030年，5-ALA的全球市场规模将达到1.5958亿美元。
代谢工程提供了一种有效的方法来操纵天然或异源代谢途径，以促进5-ALA的积累。大肠杆菌和谷氨酸棒杆菌都具备固有的C5途径，该途径通过三个酶促反应将谷氨酸转化为5-ALA。然而，由于天然途径的严格调控和前体流动方向的多样性，这一途径的5-ALA生产受到了限制，5-ALA最高产量仅为11.4 g/L，生产率为0.19 g/L/h。为了克服这些挑战，研究人员引入了来自光合细菌的异源C4途径。该途径只涉及单一的5-ALA合成酶（ALAS），催化琥珀酰辅酶A和甘氨酸的缩合反应生成5-ALA。通过酶筛选、途径工程、耐受性工程、反馈抑制解耦和发酵过程优化等多种策略，C4途径的5-ALA生产水平得到了显著提升。然而，与谷氨酸或赖氨酸等典型氨基酸的生物生产性能相比，5-ALA生产菌株的改良和技术创新仍有很大的提升空间。
高效ALAS的挖掘与表征
5-ALA合成酶（ALAS）是构建5-ALA细胞工厂的关键酶。为了挖掘自然界中潜在的高效ALAS，作者首先通过数据库挖掘潜在的ALAS，发现其在进化上具有明显的多样性。随后采用一种深度学习模型DLKcat来预测候选酶的kcat值，前10名中仅有一个被报道，且与常用的几种ALAS之间存在较大的序列差异。根据体外酶活测定和体内异源表达，作者选取了ALASkd用于后续细胞工厂的构建。
图1 挖掘和表征新型ALAS
基因组规模建模助力靶点识别和组合工程
为了系统地确定工程靶点，作者使用大肠杆菌通量平衡分析（FBA）工具量化了影响5-ALA生产的通量。根据通量分布计算反应得分和基因得分，确定了潜在的靶点基因，它们分布在11个通路。随后，作者理性选择了其中的四个靶点进行验证：在柠檬酸循环中，敲除sucCD来增强琥珀酰辅酶A的供应；在叶酸代谢中，选择敲除gcvP以防止甘氨酸降解；在卟啉代谢中，下调hemB以减少5-ALA中卟啉的生物合成；过表达5-ALA转运蛋白EamA用于缓解反馈抑制。通过敲除sucCD和gcvP、促进HemB的降解和过表达外排蛋白EamA，5-ALA的产量从1.29 g/L（菌株R1）提高至4.69 g/L（菌株R6）。
图2 靶点预测和组合工程
碳通量和氧化还原之间的不平衡
为了评估工程菌株R6生产5-ALA的潜力，作者在5 L发酵罐中对其进行补料分批发酵。结果显示菌株R6的5-ALA产量达到21.82 g/L，产率为0.192 mol 5-ALA/mol葡萄糖。但菌株R6在19 h后生长迅速下降，且5-ALA的生产在26 h后停滞。考虑到5-ALA的产率较低，作者进一步分析了发酵过程中的碳通量溢出，发现菌株R6在发酵过程中产生了大量的乙酸，19 h后观察到乙酸的急剧增加，与其生长停滞相符合，表明乙酸产生过量阻碍了5-ALA的持续生产。因此，作者对乙酸合成基因pta-ackA和poxB进行了敲除，分别生成菌株R7和菌株R8。但实际效果并不理想，反而促进了甲酸和乳酸的积累。作者进一步对不同生长阶段细胞内NADH/NAD+比值的分析，发现与对照相比，菌株R6、R7和R8的NADH/NAD+比值显著增加，特别是在细胞生长下降阶段。因此，氧化还原辅因子的不平衡是菌株生长下降难以持续生产5-ALA的重要原因。
图3 碳通量和氧化还原辅因子之间的不平衡
用于感应细胞内氧化还原状态的动态调节模块的设计
为了调节氧化还原辅因子和碳通量之间的不平衡，作者选择了来自肺炎链球菌的NADH氧化酶NoxE。在DRM的控制下，NoxE将NADH氧化为NAD+和H2O，并且使用转录因子Rex感知细胞内NADH/NAD+比值，构建人工氧化还原稳态系统。为了评估Rex对NADH/NAD+比值的响应，作者使用合成启动子PDRM1驱动GFP的表达，使用组成型启动子Ptac驱动Rex的表达。随后，通过向大肠杆菌中引入不同的碳源，作者对该系统进行了评估，结果显示细胞内NADH/NAD+比值与GFP强度之间存在线性相关，证实该系统可以响应胞内氧化还原状态。此外，作者开发了一种嵌合Rex阻遏蛋白，将CI阻遏蛋白的93-236个氨基酸的四聚化结构域融合到Rex的C末端，进一步降低了该系统的泄露。
图4 响应 NADH/NAD 比率的动态调节模块 （DRM） 的设计
利用开发的DRM对NoxE的表达进行微调
随后，作者将DRM导入菌株R6中，产生菌株R9，其在24 h后5-ALA的产量为5.45g/L，与菌株R6相比提高了16.5%。菌株R9在5-ALA产量、细胞生长和乙酸溢出方面均有显著改善，同时胞内NADH/NAD+比值大幅降低，表明该动态调控系统有效缓解了氧化还原状态和与乙酸生成相关的碳通量之间的不平衡。然而，发酵过程中仍然观察到菌株R9的胞内NADH/NAD+比值和乙酸分泌增加，表明NoxE的表达量不足以有效回收过量的NADH，需要进行微调。为了微调DRM，作者使用9个强度不同的启动子替换了noxE的初始启动子，生成了菌株R10-18。发酵结果显示，菌株R11的5-ALA产量最高（6.35 g/L），乙酸溢出最低。此外，为了评估整个发酵过程中NADH氧化酶表达的动态变化，作者将noxE与gfp共表达，有助于监测细胞内NADH/NAD+比值和noxE表达的变化。结果显示菌株R11的NADH/NAD+比值和noxE表达量的振荡模式更规律，振幅更大，表明菌株R11中的DRM为noxE的表达提供了最佳调节。
图5优化noxE-Rex振荡系统
用于微调氧化还原稳态的其他辅因子的协同优化
作者测定了R11菌株细胞内CoA的浓度，发现CoA水平随着细胞生长和5-ALA的生产而下降，表明辅因子不足可能限制了其生产能力，在发酵过程中需要额外补充CoA。PLP是ALAS的重要辅因子，而CoA参与前体琥珀酰CoA和关键中间体乙酰CoA的生成。因此，作者在菌株R11发酵过程中添加不同浓度的PLP和泛酸（一种CoA前体），发现5-ALA的产量均明显提高，表明两个辅因子的优化是扩大规模的必要条件。最后，基于中心复合设计和响应面优化，作者进一步优化了启动子强度、PLP浓度和泛酸浓度三个因素，在5 L发酵罐中使5-ALA的产量达到63.39 g/L，这是至今报道的最高水平。
图6微调氧化还原稳态协同优化其他辅因子
原文链接：
https://doi.org/10.1016/j.tibtech.2024.06.004
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摘译 |卢其圆
编辑 | 王咏桐
左莎莎
陈嘉序
审核 | 刘 娟
