I 论文导读 |
近年来，随着冠状病毒家族中新成员的不断出现，特别是那些能够引起严重疾病的病毒，如SARS-CoV、MERS-CoV以及最近的SADS-CoV，全球对冠状病毒的研究给予了极大的关注。猪急性腹泻综合征冠状病毒（SADS-CoV）是一种新兴的α冠状病毒，它能够引起仔猪的严重腹泻并导致重大的经济损失。SADS-CoV的刺突蛋白（S蛋白）是病毒粒子的关键结构成分，它与宿主受体的相互作用以及中和抗体的产生密切相关。鉴于SADS-CoV潜在的人畜共患传播风险，对S蛋白上表位的鉴定和筛选对于开发敏感且特异的诊断工具至关重要。然而，目前对于SADS-CoV S蛋白结构的理解仍然有限，特别是其B细胞表位的鉴定和分析，这对于疫苗设计和诊断方法的发展具有重要意义。
IF：7.7 中科院1区 | JCR/Q1 生物学 参考译文：猪急性腹泻综合征冠状病毒刺突蛋白上两个新B细胞表位的鉴定 第一作者： Liaoyuan Zhang , Xiaoman Yang |
I 主要研究结果 |
图1.SADS-CoV重组抗原蛋白的纯化和免疫学评价
3.2 SADS-CoV S蛋白特异性单克隆抗体的生产和鉴定
在本研究中，我们通过免疫BALB/c小鼠与重组SADS-CoV S三聚体蛋白，成功产生了特异性针对SADS-CoV S蛋白的单克隆抗体（mAbs）。利用标准杂交瘤技术，从小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合后筛选出阳性杂交瘤细胞。经过三次克隆化，我们获得了两个特异性的单克隆细胞系，分别产生mAb 8D6和6E9。这两个mAb通过免疫荧光分析显示能够与SADS-CoV感染的LLC-PK细胞发生特异性反应，而对PEDV、TGEV或PDCoV感染的细胞无反应。此外，mAb 6E9属于IgG1/κ型，而mAb 8D6属于IgG2b/κ型。尽管这两个mAb在SADS-CoV感染的Vero E6细胞中未显示出中和能力，但它们通过ELISA显示出对S1蛋白具有较高的亲和力，EC50值分别为308.2 ng/mL和1006 ng/mL。免疫组织化学分析进一步证实了mAb 8D6和6E9能够特异性地识别接种SADS-CoV的动物小肠中的S蛋白。这些结果表明，我们制备的mAb可以作为研究SADS-CoV S蛋白功能和开发诊断方法的有用工具。
图2.两种单克隆抗体的反应性
3.3 单克隆抗体的表位定位
在本研究中，我们通过一系列策略对单克隆抗体8D6和6E9所识别的SADS-CoV S蛋白的B细胞表位进行了精确的定位。首先，我们将S蛋白分解为六个片段，并通过与hFc或GST标签融合的截短多肽在HEK293T细胞中表达，以进行初步筛选。通过蛋白免疫印迹分析，我们发现8D6识别的表位位于氨基酸276至404之间，而6E9识别的表位位于氨基酸404至547
进一步的表位定位实验通过构建更精细的多肽片段，并利用GST标签在HEK 293T细胞中表达，然后进行western blot分析。经过几轮筛选，我们最终确定了8D6识别的最小表位为311NPDQRD316，而6E9识别的最小表位为492ARFVDRL498。这些表位的鉴定是通过连续缩小候选区域并使用特异性mAb进行验证来实现的。
此外，我们还对这些表位在不同SADS-CoV亚型中的保守性进行了同源性分析，发现这两个表位在13种典型毒株中高度保守。这些发现不仅有助于我们深入理解SADS-CoV S蛋白的结构特征，而且对于疫苗设计和诊断方法的开发具有重要的应用价值。
图3.单克隆抗体8D 6识别表位的鉴定
图4.单克隆抗体6E9识别表位的鉴定
3.4 序列和相似性分析
进行了氨基酸比对，以评估从基因库获得的各种SADS-CoV毒株中两个已确定的表位的保守性。mAb 8D6（aa 311 NPDQRD 316）和mAb 6E9（aa 492 ARFVDRL 498）识别的两个表位在SADS-CoV毒株中均表现出高度保守性，序列相似性为100%。
3.5 已鉴定表位的空间位置和抗体-抗原相互作用分析
在本研究中，我们通过结构生物学方法探索了识别的B细胞表位的空间位置以及抗体与抗原的相互作用。利用已解析的SADS-CoV S蛋白晶体结构（PDB: 6M16），我们通过PyMOL软件将mAb 8D6和6E9识别的表位映射到S蛋白的三维结构上。结果显示，mAb 8D6识别的表位311NPDQRD316形成了一个α-螺旋结构，而mAb 6E9识别的表位492ARFVDRL498则位于S蛋白表面的一个线性区域。
为了深入了解抗体与表位之间的相互作用，我们利用Alphafold 3进行了抗体Fab片段与抗原表位复合物的结构预测。预测结果显示，表位氨基酸与mAb 8D6和6E9的轻链和重链互补决定区的某些氨基酸之间存在相互作用。特别是，对于mAb 8D6，表位中的312P、313D、314Q、315R和316D残基与抗体的轻链和重链互补决定区的关键氨基酸发生了相互作用。同样，mAb 6E9的表位中的492A、493R、494F、495V、496D、497R和498L残基也与抗体的轻链和重链互补决定区的特定氨基酸发生了相互作用。
这些相互作用的预测是基于ipTM和pTM评分进行的，其中ipTM评分大于0.8表示预测的复合物结构与真实结构相似，而pTM评分大于0.5则表明预测的复合物结构整体上与真实结构相似。这些结果不仅为理解SADS-CoV S蛋白的免疫原性提供了分子层面的见解，而且对于设计有效的疫苗和诊断工具具有重要的指导意义。
图5.单克隆抗体表位的同质性分析和表位-抗体Fab复合物的结构预测分析
| I 研究总结 |
本研究成功地在哺乳动物细胞中表达了猪急性腹泻综合征冠状病毒（SADS-CoV）的重组刺突蛋白（S蛋白），并利用该蛋白免疫小鼠，产生了特异性的单克隆抗体（mAbs）。通过对这些mAbs进行详细的表位鉴定，我们确定了两个位于S蛋白上的新型B细胞表位，分别为311NPDQRD316和492ARFVDRL498。这些表位在不同的SADS-CoV亚型中具有高度保守性，表明它们在病毒免疫反应中可能起着关键作用。
此外，我们利用结构生物学方法对这些表位进行了空间定位，并分析了它们与相应单克隆抗体之间的相互作用。这些分析结果揭示了表位在S蛋白上的确切位置以及它们与抗体结合的关键氨基酸残基，为理解SADS-CoV S蛋白的免疫原性和设计靶向这些表位的疫苗和诊断工具提供了重要的结构信息。
总之，本研究不仅扩展了我们对SADS-CoV S蛋白免疫原性的认识，而且为开发针对SADS-CoV的疫苗和诊断方法提供了有价值的候选表位。这些发现有望促进未来对SADS-CoV以及其他可能具有人畜共患潜力的冠状病毒的防控策略的发展。
https://doi.org/10.1016/j.ijbiomac.2024.135049
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