原发性硬化性胆管炎（PSC）是一种慢性胆汁淤积性肝病，与胆管进行性炎症相关，可导致纤维化和终末期肝病。胆汁酸（BA）毒性可能参与PSC的发生和疾病进展。TGR5是BA的膜结合受体，存在于胆管中，保护胆管免受BA的毒性。在这项研究中，我们发现来自PSC肝脏的胆管和来自PSC遗传小鼠模型的胆管中TGR5水平降低。我们的研究表明，胆管中较低水平的TGR5可能有助于PSC的发生和进展。此外，norUDCA（一种目前正在PSC III期试验中测试的药物）治疗可恢复胆道上皮细胞中的TGR5水平。
原发性硬化性胆管炎（PSC）是一种罕见的胆汁淤积性肝病，其特征是肝内和肝外胆管的慢性炎症和进行性纤维化。PSC发生肝脏恶性肿瘤的风险增加，主要是胆管癌。遗传、环境和免疫危险因素、肠道微生物群和肠-肝轴的失调、胆汁成分和胆道上皮细胞（BEC）表型的改变都与PSC的病因有关。目前，还没有药物治疗被批准用于PSC。
缺乏磷脂翻转酶Mdr2（Abcb4-/-）的小鼠重现了人类PSC的进行性纤维化胆管炎，且会发展为肝内恶性肿瘤。因此，Abcb4-/-小鼠被广泛用作硬化性胆管炎的模型。疏水胆汁酸（BA）石胆酸（LCA, 1%w/w）在野生型（WT）小鼠2-4天内导致破坏性胆管炎和管周纤维化，虽然该模型类似于PSC中观察到的胆道变化，但LCA不能长期耐受。
Takeda G蛋白偶联受体-5（TGR5，也称为GPBAR1）是一种G蛋白偶联受体，对初级和次级BAs均有反应。TGR5在啮齿动物和人类的整个胆道树中表达，并在小、大肝内胆管、肝外胆管和胆囊上皮内的BECs中被检测到。BECs中TGR5的激活刺激环AMP的生成，导致氯和碳酸氢盐分泌增加，导致富含碳酸氢盐的胆汁分泌。此外，TGR5有助于BEC紧密结合的完整性。因此，TGR5保护BECs免受BA毒性，这解释了在BA攻击后缺乏TGR5的BECs存活率显著降低的原因。TGR5激活也促进BEC增殖，在胆汁淤积模型中，TGR5 -/-小鼠的BEC增殖减弱。TGR5在BECs中的显著表达以及该受体参与胆道分泌、细胞保护和增殖，强调了肝胆组织对TGR5的生理需求，并提示其可能在胆管疾病的发病机制中发挥作用。TGR5在PSC中潜在作用的进一步证据来自全基因组关联研究：与溃疡性结肠炎和PSC相关的基因位点包含TGR5基因位点。BECs中TGR5的表达、定位和功能的变化是否参与PSC的发病机制尚不完全清楚。
本研究的目的有四方面：1)研究PSC和Abcb4-/-肝脏BECs中TGR5表达和定位的改变；2)确定硬化性胆管炎背景下BECs中TGR5的潜在调节因子；3)探讨TGR5缺乏是否易患硬化性胆管炎，而TGR5过表达是否会减轻硬化性胆管炎；4)确定潜在的治疗策略。
✦TGR5 fluorescence intensity is reduced in BECs in PSC livers
✦TGR5-expression levels are reduced in intra- and extrahepatic ducts of Abcb4-/- mice
✦Interleukin-8 (CXCL-8) and its murine homologues suppress TGR5 levels in murine and human cholangiocytes
✦Reduced TGR5 levels are associated with decreased TGR5 signaling in BECs and predispose to more severe biliary injury
✦Single-cell RNA-sequencing reveals intrahepatic cholangiocytes from Abcb4-/- mice have an activated, inflammatory phenotype
✦TGR5 overexpression improves sclerosing cholangitis in Abcb4-/- mice
✦NorUDCA restores TGR5 levels in BECs of Abcb4-/- mice
慢性炎症、胆汁淤积和纤维化是PSC的特征。该疾病的最初触发因素仍然未知，在不同的患者群体中可能有所不同。据推测，在遗传易感个体中，胆道上皮暴露于病原体或微生物衍生产物可能引发激活的促炎BEC表型的发展，这种表型在PSC和Abcb4-/动物中都有发现。由于TGR5在BECs中高表达并具有保护作用，我们评估了PSC患者和Abcb4-/动物肝脏中TGR5的表达、定位和信号传导的变化。对不同肝脏疾病（PSC、PBC、NASH、DILI、病毒性肝炎）肝脏组织的评估显示，TGR5仅在PSC肝脏的BECs中显著下调。这种下调存在于疾病的早期阶段，并在整个疾病进展过程中持续存在。如前所述，在肝内CD206+ -巨噬细胞中未观察到TGR5荧光强度的降低。
因此，在Abcb4-/-动物的全肝组织中检测到更高的TGR5 mRNA水平，这可能归因于Abcb4-/-小鼠肝脏中表达TGR5的单核/巨噬细胞的积累。相反，在FACS分离的BECs（WT水平的50.6%）以及Abcb4-/-小鼠的微解剖肝内管（WT水平的59.3%）和肝外胆管（WT水平的43.8%）中检测到TGR5 mRNA水平显著降低。此外，通过免疫荧光染色测定的TGR5蛋白水平在Abcb4-/-动物的肝内和肝外BECs中显著降低，表明TGR5具有细胞特异性调节。
由于体外培养的Abcb4-/- BECs与WT小鼠之间TGR5表达没有差异，我们推测BECs中TGR5表达的降低是由于周围微环境中疾病相关的变化。反应性BEC表型的发展，其特征是细胞增殖增加，促炎细胞因子，趋化因子和粘附分子（如Icam1, Vcam1）的表达和分泌增加，这些都已被在PSC中被报道。胆道损伤的持续可能引发BEC衰老的发展，从而以旁分泌方式加重和延续胆道损伤。的确，使用scRNA-seq，在Abcb4-/-动物的BECs中检测到Icam1-、Vcam1-、Ccl2和Tgfβ2的表达显著增加。
PSC患者的胆汁和血清中高水平的IL-8可能是一个预后因素，并与无移植生存降低有关。IL-8作为中性粒细胞趋化剂和激活剂，在PSC胆道损伤后早期和胆道闭锁时上调。因此，我们验证了IL-8是否调节TGR5的表达。用IL8/ IL8同源物刺激小鼠和人BECs分别导致TGR5 mRNA和蛋白水平下降。在小鼠BECs对Tnfa、Il6、Il1b和Ccl4的反应中，或用Cxcr1/2抑制剂预处理的细胞/类器官中，没有观察到这一点。
然而，我们不能排除其他因素，如胆道衰老或其他旁分泌因素参与了TGR5的下调。为了研究TGR5水平的降低是否足以影响TGR5信号传导从而影响BECs的细胞保护机制，在FACS分离的BECs中分析了Erk1/2的磷酸化作用。与TGR5水平降低一致，检测到较低的Erk1/2磷酸化。可能有独立于TGR5的因素对Erk1/2激活降低产生影响。TGR5在BECs中的另一个下游效应是细胞增殖。虽然来自TGR5-/-小鼠的BECs对胆汁酸(BAs)没有反应性增殖，但由细胞因子/趋化因子诱导的细胞增殖未受影响。由于Abcb4-/-小鼠中的细胞因子/趋化因子水平显著升高，因此可以独立于TGR5触发胆管细胞增殖。在异型TGR5缺陷小鼠中分析了TGR5在BECs中对抗胆汁酸毒性效应的保护作用，结果被石胆酸LCA质疑。TGR5杂合子动物发展为严重的胆管炎表型支持这样一个假设：TGR5蛋白水平的减少足以使肝内和肝外胆管上皮细胞（BECs）更容易受到细胞损伤。相比之下，在Abcb4-/-小鼠中过表达TGR5改善了硬化性胆管炎并缓解了反应性BEC表型，这一点通过减少Icam1、Vcam1和Cxcl1的表达以及抑制炎症途径得到证明。这些数据强调了增强TGR5表达和信号传导可能预防炎症性、反应性BEC表型的发展。实际上，通过给予双重TGR5/FXR激动剂（INT-767）和通过喂食norUDCA，Abcb4-/-小鼠的硬化性胆管炎得到了改善。在体外，norUDCA、tauro-norUDCA和UDCA完全恢复了在Cxcl1/IL8处理的小鼠/人类中BCEs的TGR5 mRNA水平。
在体内，UDCA喂养导致BECs中的TGR5水平显著升高，然而这些水平并未达到野生型(WT)水平。相比之下，经过norUDCA处理后，BECs中的TGR5 FI恢复到了WT水平。可能是因为体内存在胆肝分流，norUDCA达到的胆汁浓度高于UDCA或tauro-norUDCA。UDCA和norUDCA都具有抗炎作用，这可能有助于在Abcb4-/-小鼠中上调胆管TGR5水平。增强的胆管TGR5表达可能会放大norUDCA依赖的胆汁碳酸氢盐分泌增加。
综合来看，原发性硬化性胆管炎（PSC）和缺乏Abcb4的小鼠中观察到的胆管TGR5表达下调，有助于促发炎症反应性胆管上皮细胞（BEC）表型的发展。在Abcb4-/-小鼠中，通过TGR5的过表达或通过norUDCA恢复TGR5水平，可以减轻这种现象。保护和上调TGR5表达可能是norUDCA活性迄今为止未被描述的机制，因此，在PSC中上调TGR5水平可能证明是有益的。
