ME | 中科院天津工生所张学礼研究员团队改造耐酸酵母Pichia kudriavzevii在低pH条件下生产L-苹果酸

L-MA是一种C4-二羧酸，与柠檬酸相比，它具有更强的酸度和更好的风味保留，因此在食品和饮料工业中常用作酸化剂和风味增强剂。在过去的几十年里，细菌、酵母、丝状真菌已经被改造成生产对构象纯的L-MA。然而，只有丝状真菌成功地用于大规模生产。然而，丝状真菌在发酵中的应用仍然面临着一些挑战，如发酵周期长，菌丝在液体培养中容易结块，以及为防止发酵液变得过酸而需要大量中和剂，产生的废盐会对环境产生危害。废盐后处理的高成本也增加了整体生产成本，下游处理占微生物酸发酵总成本的50%以上。相比之下，一些耐酸微生物宿主的发酵可以在3.0左右的pH值下进行，此时羧酸以未解离的形式为主，这大大简化了下游加工。然而，之前在低pH条件下应用微生物发酵生产L-MA的尝试都没有成功，因为L-MA的滴度随着pH的降低而急剧下降。

Pichia kudriavzevii是一种优秀的耐酸酵母，可以在pH低于2.0的恶劣环境中生长。与丝状真菌相比，P. kudriavzevii作为有机酸的生产宿主具有几个优势，包括更快的生长，液体培养过程中细胞形态的均匀性更好，以及更简单的遗传操作。迄今为止已经通过改造P. kudriavzevii实现了琥珀酸(SA)的工业化生产。

图1 P. kudriavzevii高效合成L-MA途径构建示意图

研究表明，P. kudriavzevii可以自然积累乙醇和甘油。因此，首先敲除菌株ΔURA3中的PkPDC1基因(编码丙酮酸脱羧酶)和PkGPD1基因(编码甘油-3-磷酸脱氢酶)，生成菌株MA002，从而完全阻断副产物的合成。MA002在含40 g/L CaCO₃的培养基中摇瓶发酵34 h，分别合成1.26 g/L L-MA和4.96 g/L丙酮酸(PYA)。进一步敲除PkPCK1基因(编码磷酸烯醇丙酮酸羧激酶)和PkMDH2基因(编码假定的细胞质苹果酸脱氢酶)产生菌株MA003，从而通过糖异生途径阻止胞内L-MA的消耗。在含有40 g/L CaCO₃的培养基中摇瓶发酵34 h，MA003中L-MA的滴度比MA002提高了32.5%，达到1.67 g/L。

考虑到通过EMP和rTCA途径生产L-MA可以达到理论最大产量，随后从不同物种中筛选关键的rTCA途径酶，包括丙酮酸羧化酶(PYC)和细胞质苹果酸脱氢酶(MDH)。通过过表达两个PYCs的所有组合构建MA005系列菌株。在含40 g/L CaCO₃的培养基中摇瓶发酵34 h，所有菌株的L-MA产量都低于3 g/L，这表明P. kudriavzevii可能无法有效地自行分泌L-MA。随后，在MA005系列菌株中分别过表达SpMAE1基因，以增强L-MA的外排，从而产生MA006系列菌株。在含CaCO₃ 40 g/L的培养基中摇瓶发酵34 h，发现大多数MA006系列菌株的L- MA产量从小于3 g/L显著增加到大于29 g/L，表明SpMAE1可以有效L-MA的外排。此外，还观察到琥珀酸(SA)和PYA作为主要副产物积累。

为了减少副产物PYA的积累，首先删除了MA006-10中的PkMAE1基因(编码一种NAD-依赖性苹果酶，催化L-MA转化为PYA)，生成菌株MA007-1。与MA006-10相比，MA007-1的L-MA滴度和产量分别提高了13.7%和11.2%。相比之下，PYA和SA的滴度变化不大。进一步测试了PYA的积累是否是由于AoPYC的催化效率不足引起的，在培养基中添加0.4 mg/L生物素进行PYC转化。此外，由于P. kudriavzevii CY902的基因组中不包含编码生物素导入的基因，通过将生物素导入基因SpVHT1 插入到菌株MA007-2的PkMAE1位点。摇瓶发酵结果显示，与MA007-1相比，MA007-2中PYA的积累量减少了12.7%，而L-MA和SA的产量没有明显变化。

磷酸烯醇丙酮酸羧化酶(PPC)以碳酸氢盐为底物催化磷酸烯醇丙酮酸(PEP)生成草酰乙酸。为了测试PPC的引入是否可以减少PYA的积累，在PkJEN2-2位点(编码P. kudriavzevii的一个次要的C4-二羧酸内运基因)过表达大肠杆菌来源的PPC，在发酵22 h后，与对照MA008-1相比，EcPPC过表达导致L-MA滴度(提高21.5%)和产量(提高18.5%)更高，但PYA和SA的积累没有减少。

图2 丙酮酸和草酰乙酸节点通量对L-MA合成和副产物积累的影响

由于P. kudriavzevii的基因组中没有检测到编码可溶性富马酸还原酶如FRD或OSM的基因，推测副产物SA是通过氧化TCA途径产生的。由于琥珀酸盐带负电荷，不能自由穿过线粒体膜，进一步测试了线粒体上的羧酸转运体是否介导了SA从线粒体基质到细胞质的运输。对CY902基因组的注释表明，P. kudriavzevii含有两个线粒体蛋白PkODC1 和PkSFC1，具有潜在的二羧酸跨膜转运蛋白活性。因此，灭活了MA008-3中的PkODC1和PkSFC1，分别得到菌株MA009-6和MA009-7。与MA008-3相比，PkODC1和PkSFC1的失活并没有改变副产物SA的积累，这表明SA可能通过其他未知机制被运输出线粒体。

图3 线粒体二羧酸载体PkODC1和PkSFC1对L-MA合成和副产物积累的影响

低pH下的L-MA合成需要额外的细胞质NADH供应

从理论上讲，葡萄糖通过rTCA循环转化为L-MA是氧化还原中性的。鉴于MDH已经过度表达，因此推测细胞质内NADH供应可能已经耗尽。为了验证猜想，在MA008-3的Pk2365位点过表达大肠杆菌衍生的可溶性吡啶核苷酸转氢酶基因EcSthA(将胞质NADPH转化为NADH)。产生菌株MA009-10。此外，我们还构建了缺失Pk2365而不表达EcSthA的对照菌株MA009-5。比较了MA009-5和MA009-10在没有CaCO₃的摇瓶发酵中48小时的L-MA生产曲线，发酵12 h后，MA009-5和MA009-10的L-MA和SA的产量以及葡萄糖消耗没有显著差异。然而，PYA的积累从1.35 g/L下降到0.19 g/L，表明PYA积累的减少与葡萄糖消耗速率无关，而是由EcSthA过表达引起的。MA009-5和MA009-10的PYA滴度在36 h达到最高，分别为7.9 g/L和2.9 g/L。这表明EcSthA的过表达为MDH提供了更多的NADH来催化草酰乙酸转化为L-MA。由于MA009-5的葡萄糖消耗在18 h后下降，MA009-5的L-MA滴度在24 h时达到最大值9.6 g/L，此时剩余葡萄糖浓度仍为35.5 g/L，这表明PYA的积累引起糖酵解途径的反馈抑制，导致NADH供应更加不足。此时，细胞内L-MA合成停滞，而细胞外L-MA的代谢利用得到加强。相比之下，MA009-10的L-MA产量达到38.3 g/L的最大滴度，并在48 h时增加，直到葡萄糖耗尽，此时培养液的最终pH达到2.14。与MA009-5相比，MA009-10的L-MA产率下降得更慢，说明在NADH供应充足的情况下，MA009-10可以在不增加CO2供应的情况下维持L-MA的生产。

图4 过表达EcSthAt提高低pH条件下L-Ma的合成

组学数据揭示EcSthA对中心碳代谢的调节作用

由于MA009-5和MA009-10在没有中和剂的情况下培养18 h后L-MA产量和葡萄糖消耗有显著差异，进一步分析了这两个菌株在这个时间点的转录组学和代谢组学数据。在糖酵解途径和戊糖磷酸途径(PPP)的推定基因中，有15个在MA009-5和MA009-10之间的表达水平显著改变(PkZWF1、PkGND2、PkRPE1、PkTKL1、PkTAL1、PkGLK1、PkHXK2、PkPGI1、PkPFK1、PkPFK2、PkFBA1、PkTPI1、PkENO1、PkCDC19上调，PkGPM1下调)。同时，AoPYC和EcPPC的转录丰度在EcSthA过表达后分别增加了3.2倍和2.3倍。而AoMDH的表达水平没有变化。这些结果表明，EcSthA的过表达引起NADPH和NADP+的循环相互转化，激活戊糖磷酸途径，增加细胞质内NADH的供应。

糖酵解和PPP通路中间代谢物含量变化的代谢组学分析同样表明，EcSthA的过表达有助于这两个通路的激活(6-磷酸葡萄糖酸、糖庚糖-7-磷酸、甘油醛-3-磷酸、二羟基丙酮-磷酸、3-磷酸甘油酸、2-磷酸-D-甘油酸、磷酸烯醇丙酮酸丰度增加，而D-葡萄糖-6-磷酸、丙酮酸丰度降低)。与对照菌株MA009-5相比，MA009-10中rTCA途径相应代谢物含量显著增加。此外，发现戊糖磷酸途径的激活增加了葡萄糖-6-磷酸的消耗，代谢组学结果显示MA009-10细胞内葡萄糖-6-磷酸浓度显著降低。

图5 基于转录组学和代谢组学数据分析EcSthA过表达对中心碳代谢的影响

在MA009-10的PkGPD1启动子位点上补充PkURA3基因，获得了MA009-10-URA3菌株。在培养基中添加20 g/L CaCO₃碳酸钙，使其初始pH达到5.0左右，发酵过程中不再添加碱来调节pH。为减少胞质NADH的消耗，提高L-MA的产率，采用微氧发酵，控制进气量为1 L/min。发酵36 h后培养基的pH降至2.5左右。在这个时间点，可以观察到L-MA的生成速度明显减慢，尽管培养基中仍有大量葡萄糖未被使用。发酵60 h时100 g/L葡萄糖完全耗尽，此时培养液pH为2.48，最终L-MA滴度为53.2 g/L，对应的产率和产量分别为0.89 g/L/h和0.51 g/g葡萄糖。为了进一步提高L-MA的生产滴度，尝试进一步增加CaCO₃的添加量至70 g/L。在发酵过程中，培养基的pH除了有两个时期出现反弹上升外，总体呈下降趋势。在前24小时观察到的pH升高是由沉淀的CaCO₃转化为水溶性苹果酸钙引起的。相比之下，在发酵74 h时观察到的pH从3.15增加到3.53，认为是由于细胞破裂导致中性细胞质成分释放到培养基中，因为细胞OD₆₀₀在此期间也从16.6下降到14.9。107 h后，200 g/L葡萄糖完全消耗，此时培养液pH为3.1，最终L-MA滴度达到199.4 g/L，产率和产量分别为1.86 g/L/h和0.94 g/g葡萄糖(1.27 mol/mol)。主要副产物是SA和PYA，滴度分别为22.4和6.9 g/L。相比之下，丝状真菌发酵L-MA需要使用150 g/L的CaCO₃，本研究中使用的剂量减少了50%以上。

图6 菌株MA009-10-URA3微氧间歇发酵曲线