脂质纳米颗粒中的胆固醇组分是否真的“人畜无害”？被巨噬细胞捕获后都去了哪里？

脂质纳米颗粒（LNP）是目前研究最为充分的mRNA递送系统。LNP通常由四种成分组成：可电离脂质/磷脂/胆固醇/聚乙二醇脂质（PEG脂质）。脂质成分的物理和化学稳定性影响粒径、电荷、膜流动性和配方稳定性，对于有效的LNP药物递送至关重要。

一般而言，由于可电离脂质和PEG脂质具有的天然免疫原性，在LNP递送系统的开发过程中获得了更多关注。对于mRNA疫苗来说，mRNA-LNP具备的天然佐剂特异性是有利的，但是过度的炎症反应会抑制抗原表达，并且还是一系列接种副作用的根源，容易引发局部疼痛、肿胀、发烧和罕见的心肌炎等不良反应。

可电离脂质被认为是mRNA递送系统的核心组分，除了具有响应内体pH质子化促进mRNA的胞内释放外，还可通过添加功能性基团赋予载体特异性器官/组织靶向性。目前FDA批准的可电离脂质如DLinMC3-DMA (MC3)、ALC-0315及SM-102大多是通过迈克尔加成或环氧化合物开环反应合成的，均无法被生物降解，在体内蓄积将产生潜在的细胞毒性。

PEG脂质用于减少网状内皮系统（RES）的调理素作用和摄取，从而赋予纳米颗粒“隐形特性”。然而，大量研究报道了PEG脂质可能会通过一种称为“加速血液清除”（ABC）的现象矛盾地增加血液中的清除率。由于PEG脂质在日常生活中的广泛应用，这一现象也被认为是由机体原有的抗PEG抗体引起的，不利于相关载体的有效递送。

胆固醇是细胞膜的主要成分，负责细胞膜的稳定性、流动性和渗透性。因此，胆固醇也用于脂质体中，以实现类似的稳定功能。由于对胆固醇组分“人畜无害”的普遍认知，研究界几乎忽略了胆固醇被免疫细胞摄取后的体内代谢命运以及相关产物对免疫调节的影响，但胆固醇稳态和代谢是免疫调节的关键。因此，有必要进一步了解人体调节细胞-LNP相互作用、细胞胆固醇代谢的常见机制，以及胆固醇分解产物（如氧甾醇）的免疫调节机制。

2024年10月10日，德克萨斯理工大学Ninh M La-Beck团队在期刊ACS Nano上发表了题为“Immune Implications of Cholesterol-Containing Lipid Nanoparticles”的综述[1]。研究团队回顾了内源性胆固醇的细胞摄取、运输、代谢和免疫调节机制，以此引申到含胆固醇纳米颗粒的细胞内命运，以便开发更安全、更有效的脂质纳米颗粒递送系统。

研究纳米颗粒胆固醇的体内命运前需要了解脂质载体如LNP的药代动力学（PK）。通常情况下，由于脂质纳米颗粒倾向于被网状内皮系统（RES）中的巨噬细胞摄取【也称为单核吞噬细胞系统（MPS）】，LNP药物递送主要与药物在脾脏和肝脏中的积累有关，全身给药的LNP还被发现在骨髓巨噬细胞中积累。mRNA-LNP在给药后，会迅速被体液中的蛋白质覆盖（包括白蛋白、免疫球蛋白、补体蛋白和载脂蛋白等），形成蛋白质冠，改变LNP的表面特性，并影响它们与巨噬细胞和其他细胞的相互作用。巨噬细胞识别吸附到纳米颗粒表面的蛋白质，包括补体激活蛋白（调理素），促进其吞噬并随后从循环中清除。LNP和MPS之间的相互作用通常会限制纳米颗粒在靶组织部位的积累，同时增加巨噬细胞中的积累，从而导致炎症和毒性反应。

徐州医科大学曾令宇团队在一项研究中发现，小鼠体内施用200 mg/kg以胆固醇和磷脂为主要成分的脂质体后，促进了骨髓中的骨髓细胞分化和巨噬细胞向泡沫细胞表型的发展，这里的泡沫细胞类似于动脉粥样硬化斑块中常观察到的炎性巨噬细胞，而施用不含胆固醇的脂质体则并没有刺激泡沫细胞的形成[2]。

泡沫细胞指的是吞噬了脂质的单核细胞或组织细胞，其胞浆中含有许多脂滴，是动脉粥样硬化斑块内出现的特征性病理细胞。由于内质网（ER）的脂滴生物发生过程异常，脂质体介导了NF-κB信号通路诱导ER应激并上调炎症基因，导致炎性细胞因子IL-6和IL-1β的分泌增加。

图1. 巨噬细胞中脂质体和脂蛋白命运

进一步研究表明，脂质体的施用与M0和M2型巨噬细胞中较高的脂质保留有关。巨噬细胞内化后，LNP被溶酶体磷脂酶破坏，产生游离脂肪酸和游离胆固醇，积累为主要由三酰基甘油和胆固醇酯组成的脂滴。由此导致的脂滴积累可能会激活巨噬细胞向类似于泡沫细胞功能失调的表型发展。

事实上，观察到脂质体中的胆固醇含量与泡沫细胞形成的严重程度之间存在直接相关性，并且80-100 nm大小的含胆固醇外泌体载体也观察到了类似的现象。考虑到泡沫细胞通常与氧化的低密度脂蛋白（LDL）积累相关，脂质体有可能通过类似的氧化途径进行代谢。巨噬细胞中胆固醇羟化酶和活性氧（ROS）的高表达表明它们很容易从LNP相关胆固醇中产生氧甾醇。

增加脂质体的胆固醇含量会增加脂质体的消除率，但具体的清除机制尚未明确，大多数研究监测释放的药物载荷，而不是直接追踪脂质体胆固醇和脂质。因此，考虑胆固醇的清除途径可能与脂蛋白重叠。ABCG5和ABCG8是仅在肝细胞和肠道上皮细胞中表达的半转运体蛋白，它们以异二聚体形式介导细胞内胆固醇和植物固醇流出至胆管和肠腔中。据研究估计，经肠胆固醇排出（TICE）途径占人类胆固醇排出量的35%。

图2.胆固醇的转运和清除

此外，胆固醇还容易受到多种氧化途径的影响。胆固醇氧化导致在胆固醇的甾醇核或侧链上添加羟基、羰基或环氧化物官能团，产生氧化衍生物如氧甾醇。内源性氧甾醇也是细胞过程的有效调节剂，与动脉粥样硬化、心肌损伤、阿尔茨海默病、帕金森病、年龄相关性黄斑变性和许多肿瘤的发病机制有关。氧甾醇可以通过结合Toll样受体（TLR）来调节免疫反应，如结合巨噬细胞上的TLR4并诱导IL-8的产生，这与CXCR2通路的下游激活和肿瘤细胞增殖有关。

一项研究在一批商业注射脂质体制剂中发现高达7.6 mg/mL的氧甾醇，但在初始制剂材料中未发现，表明它们是在脂质体制造和/或储存过程中产生的。在制造过程中，如果暴露在高温和富氧环境中，可能会加速胆固醇氧化。降低热量、减少氧气接触的冻干以及添加抗氧化剂等策略可减少胆固醇组分的氧化。

炎性细胞因子IL-8、IL-1β、IL-6、IL-12和TNFα的增加与动脉粥样硬化患者和人单核细胞系中氧甾醇7α-HC、7β-HC、7-KC、27-HC、25-HC、5α/6α-环氧胆固醇和5β/6β-环氧胆固醇水平升高相关，表明氧甾醇与炎症过程增强之间存在联系。内源性氧甾醇的免疫调节作用是高度可变的，涉及不同的机制，需要注意可能与LNP衍生的氧甾醇与细胞和细胞成分相互作用的方式存在差异。

图3. 主要胆固醇代谢物产生途径

尽管已发现大多数氧甾醇具有高度生物活性（细胞毒性、免疫调节、致突变等），但被认为安全的生物水平尚未确定。此外，这些胆固醇氧化产物对LNP制剂安全性和有效性的影响尚未完全确定。值得注意的是，患者血清中30-40 μmol/L（12-16 μg/mL）的7β-羟基胆固醇已被报道会导致动脉粥样硬化。

但胆固醇衍生物并不总是导致炎症不良反应。7α-羟基胆固醇（7α-HC）是一种主要的氧甾醇，通过CYP7A1或7α-羟化酶的限速酶作用从胆固醇衍生而来，也可以通过ROS作用以非酶促方式产生。7α-HC可以诱导巨噬细胞中IL-8（CXCL8）和趋化因子受体CCR5配体CCL4和CCL3的产生。宾夕法尼亚大学Michael J Mitchell团队开发了一种7α-羟基胆固醇取代LNP胆固醇组分的脂质纳米颗粒，可提高mRNA靶向T细胞的递送效率。此外，羟基胆固醇的引入还增加了晚期内体的产生，并减少了回收内体的存在，改变了LNP的内吞循环机制[3]。

越来越多的研究证据表明氧甾醇在恶性细胞的增殖中起关键调节作用。肿瘤细胞需要大量的胆固醇来进行膜合成，因此常观察到肿瘤细胞的LDLR上调以增加胆固醇/LDL颗粒的摄取。同时，肝脏X受体（LXR）的氧甾醇激活对免疫反应具有整体抑制作用，导致恶性细胞的增殖。

早期研究发现，含胆固醇的LNP可促进TAM浸润和肿瘤血管生成，抑制T细胞反应，并增加肿瘤生长[4]。在肿瘤组织中积累的 LNP 有可能在细胞环境中产生氧甾醇。肿瘤来源的氧甾醇能够募集促瘤巨噬细胞和中性粒细胞，从而抑制抗肿瘤免疫反应。氧甾醇还可以被其他免疫细胞（如淋巴细胞）吸收，从而抑制免疫细胞增殖。尽管如此，外源性LNP相关氧甾醇在癌症病理生理学和癌症相关免疫抑制中的作用尚未明确。

用不代谢成氧甾醇的胆固醇类似物代替LNP胆固醇可能是减轻不良免疫反应的潜在替代品。与含有胆固醇的脂质体相比，含有β-谷甾醇（植物中天然存在的胆固醇）的脂质体无显著结构差异。更重要的是，β-谷甾醇可降低胆固醇内源性氧化代谢和炎症反应，并具有抗癌活性。有趣的是，LNP在C24位点具有烷基取代的胆固醇类似物（如β-谷甾醇）促进了结构修饰和细胞摄取和保留，并增加了基因药物的递送。

其他可能的类似物包括表胆固醇（epicholesterol）、羊毛甾醇（lanthosterol）、胆甾烯酮（cholestenone）、二氢胆固醇（cholestanol）、豆甾醇（stigmasterol）、岩藻甾醇（fucosterol）、菜油甾醇（campesterol）、β-谷甾醇（β-sitostanol）、豆甾烷醇（stigmastanol）和麦角固醇（ergosterol）。更好地了解胆固醇及其类似物的免疫调节作用和代谢途径的结构-活性研究对于设计具有可调免疫调节的合成胆固醇类似物至关重要。

脂质体免疫作用的临床前评估历来依赖于体外研究和动物模型的短期研究，这最适合评估急性毒性，例如归因于血液补体激活和细胞因子产生的毒性。相比之下，免疫抑制作用，尤其是影响适应性免疫系统的免疫抑制作用，往往在较长时间后出现，并且需要更复杂的体内免疫学评估，而这些评估尚未广泛纳入临床前药物开发范式。

临床前药物开发过程中缺乏体内长期免疫学研究，这是充分实现LNP临床潜力的主要障碍。与其他疗法（如皮质类固醇）相关的长期免疫抑制已被证明对整体健康和治疗结果有不利影响。随着LNP越来越多地被研究用于动脉粥样硬化等慢性疾病的疗法开发，迫切需要更好地了解LNP相关免疫调节的长期后果。