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内容来源于ACS Catalysis
中国医学科学院药物研究所訾佳辰研究员课题组，联合中山大学巫瑞波教授课题组，在ACS Catalysis在线发表了题为“Unexpected Main-Chain-Mediated and Neutral-Intermediate-Involved Catalytic Reaction in a High-Fidelity ent-Neoabietadiene Synthase”的研究论文。
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大戟科大戟属植物狼毒大戟（Euphorbia fischeriana Steud.）是《药典》收录药材狼毒的基原植物之一。半日花烷衍生型二萜（LRD）成分群是狼毒大戟的重要抗肿瘤药效物质，其组成十分复杂，包括ent-松香烷、ent-贝壳杉烷、ent-阿替烷和ent-海松烷四种骨架。为阐明狼毒大戟中复杂LRD药效成分群的形成机制，团队对狼毒大戟进行转录组测序，通过同源比对和进化树分析，筛选到1个TPS-c家族的萜合酶EfTPS54以及4个TPS-e/f家族的萜合酶EfTPS14、EfTPS1、EfTPS41和EfTPS43。功能表征结果表明，EfTPS54为II型二萜合酶ent-copalyl diphosphate合酶，EfTPS14、EfTPS1、EfTPS41和EfTPS43分别为I型二萜合酶ent-neoabietadiene合酶、ent-kaurene合酶、ent-isopimara-7(8),15-diene合酶和ent-atiserene合酶。这五个二萜合酶的产物涵盖了狼毒大戟中所有半日花烷衍生型二萜的骨架类型。其中，EfTPS14主要产生ent-neoabietadiene以及少量ent-abietadiene。因此，狼毒大戟中的主要松香烷型骨架二萜为岩大戟内酯类化合物，其氧化后修饰的位点与ent-neoabietadiene的双键位置吻合；而少量松香烷型骨架二萜为fischerianoid类化合物，其氧化后修饰的位点与ent-abietadiene的双键位置吻合。以上结果揭示狼毒大戟LRD成分群骨架的类型和比例的形成机制。
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图1.五个候选二萜合酶产物的气相色谱检测结果。
EfTPS14是首个产物专一的ent-neoabietadiene合酶，具有新颖的酶学机制。团队进一步对EfTPS14进行多尺度模拟和定点突变实验，阐明EfTPS14催化海松烷型碳正离子中间体IM1转化为松香烷型碳正离子中间体IM3的机制是由主链介导和中性中间体参与的去质子化-再质子化协同甲基转移，主要包含以下四个证据：（1）EfTPS14的产物中检测到痕量的中性中间体ent-sandaracopimaradiene（IM2），说明IM1发生去质子化；（2）EfTPS14活性口袋中所有碱性残基的突变均不影响IM1去质子化生成IM2；（3）质子从C14直接迁移到C-16所需跨越的能垒（25.1 kcal/mol）远高于主链介导的去质子化-再质子化过程；（4）EfTPS14的G1/2 break区域的I644主链上的羰基发挥双功能，既可以作为碱来抽取质子，产生中性中间体IM2，又可以作为酸使IM2质子化。同时，I644A突变导致突变体保留抽取质子的功能，但失去传递质子的功能，即主产物从ent-neoabietadiene转变为ent-sandaracopimaradiene。接着，作者对来自Setaria italica的ent-海松烷/松香烷型二萜合酶SiTPS8的G1/2 break区域的同源位点I449和A450进行突变，结果证明这种由主链介导的去质子化-再质子化过程可能普遍存在于涉及中性中间体的二萜合酶级联反应中。此外，作者筛选到L765和L762两个位点对于IM3从C-15区域选择性去质子化生成ent-neoabietadiene至关重要。L765F/L762S双突变体使EfTPS14完全转变为ent-abietadiene合酶。以上结果揭示狼毒大戟中不同LRD骨架产生的酶学机制。
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图2.推测的ent-neoabietadiene合酶催化机制。
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图3. ent-Neoabietadiene合酶QM/MM计算和定点突变的结果。
本研究通过筛选和表征狼毒大戟中的二萜合酶，首次阐明狼毒大戟复杂LRD二萜药效成分群的关键形成机制。通过多尺度模拟技术结合定点突变实验，首次解析ent-neoabietadiene合酶的由主链介导和中性中间体参与的去质子化-再质子化的催化机制，并鉴定关键的氨基酸位点，阐明了狼毒大戟中LRD二萜骨架形成的关键酶学机制。本研究为狼毒大戟复杂药效成分群形成机制的解析奠定基础。原文链接：https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acscatal.4c05274中国医学科学院药物研究所訾佳辰研究员、中山大学巫瑞波教授和中国医学科学院药物研究所助理研究员朱建勋为论文的共同通讯作者。中国医学科学院药物研究所博士后高可和中山大学博士生徐康为是论文共同第一作者。本研究得到国家自然科学基金、中国医学科学院中央级公益性科研院所基本科研业务费项目、中国医学科学院医学与健康科技创新工程基金等项目的资助。訾佳辰研究员任天然药物活性物质与功能国家重点实验室课题组长，本课题组长期从事中药药效成分群的异源生物合成和形成机制的研究。目前，已实现檀香挥发油的克级生物制备，所产挥发油的分子比例可媲美濒危优质印度产檀香挥发油，已完成中试放大并实现转化。近年来，在Nat. Commun.、Acta Pharm. Sin. B、ACS Catal.和Metab. Eng.等期刊发表论文20余篇。
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